[发明专利]神经细胞稀疏高亮度标记重组腺相关病毒的包装方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于神经细胞稀疏高亮度标记的重组腺相关病毒的包装方法及其应用，通过将剪切酶的核心表达质粒和对应的剪切酶依赖的荧光蛋白质粒混合成表达质粒混合物，然后与重组腺相关病毒辅助包装质粒共同转染包装细胞后，经过纯化获得稳定性良好的单一重组腺相关病毒集合。相比于不同表达质粒分别单独包装成重组腺相关病毒后混合感染的方法，通过本发明可以明显降低不同重组腺相关病毒混合共感染所造成的排斥问题，获得的新型重组腺相关病毒可用于神经细胞数目稀少且高亮度的标记，结合一定的成像手段，可以获得神经细胞局部的高清形态，还可以获得单个神经细胞在全脑尺度的完整细胞形态，即单个神经细胞在全脑完整的树突纤维投射。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于神经细胞稀疏高亮度标记的重组腺相关病毒的包装方法及其应用，该重组腺相关病毒主要用于解析神经细胞切片水平局部形态以及全脑水平单个神经细胞的完整轴树突投射形态等。

背景技术

神经环路是大脑行使各项功能的结构基础，是由数量庞大、种类多样的神经元之间通过突触连接形成，其结构的精确解析有助于人们更好地理解大脑的工作原理。目前介观水平常用的研究神经环路结构的方法主要分为群体标记和稀疏标记。其中群体标记是指标记大脑特定脑区群体神经元，以研究群体神经元的神经网络结构。然而由于群体神经元中每个个体形态结构千差万别，不同个体之间轴树突纤维彼此相互缠绕，群体标记很难揭示每个个体神经元的清晰完整的结构特征，制约了对神经环路精细组织构架的理解。因此人们开发各种稀疏标记方法，以期对神经细胞进行少量高亮度标记，结合一定的成像手段，研究单个神经细胞的全脑完整形态，进而理解单个神经细胞的信息输入和输出的走向，更进一步理解不同单个神经细胞之间如何组织形成神经环路。

目前常用的稀疏标记方法主要包括转基因小鼠遗传学标记以及病毒标记等，其中病毒标记以重组腺相关病毒(rAAV)的应用最为广泛。rAAV是一种单链DNA 病毒，具有免疫原性低，可导入外源基因，能在动物体内长期稳定表达等特点，已广泛应用于大脑神经科学等多个领域的研究[1]。现有稀疏标记方法能在一定程度上满足对小鼠大脑神经细胞少量亮度较高的标记。具体的稀疏标记方法主要有：

1、通过Cre-ER转基因小鼠控制他莫昔芬剂量药物诱导[2-4]；

2、将高倍稀释的表达Cre剪切酶的rAAV病毒与Cre剪切酶依赖的表达荧光蛋白的rAAV病毒混合后注射小鼠大脑特定脑区[5]；

3、逆向标记病毒启动上游表达[6,7]；

4、利用四环素诱导表达系统中的泄露机制进行稀疏标记[7,8]。

上述方法依然存在不少问题，比如方法1中转基因小鼠药物诱导表达方法中单个神经细胞的荧光亮度相比于病毒标记神经细胞的荧光亮度仍有一定的差距，且由于不同转基因小鼠特定细胞类型神经细胞中Cre-ER表达水平差异性较大等因素，被标记的神经细胞的数量和密度均不可控。上述方法2和方法4混合两种不同的rAAV病毒注射大脑会导致每个病毒组分相互排斥，这是由病毒本身的感染特性所决定的，不同种病毒或者同种病毒携带不同元件混合共感染细胞会导致相互排斥[9-11]，进而导致被感染神经细胞长程轴突投射末梢的荧光亮度不高，无法完整高效地标记出神经细胞在全脑水平的完整轴突投射形态。同时方法2 无法实现对特定细胞类型神经细胞的标记，限制了该方法在单个特定细胞类型神经细胞完整形态研究中的应用。方法4中病毒泄露表达有一定的随机性，因此被标记神经元的数量和密度均不可控，且不同批次病毒混合标记结果差别较大。方法3中病毒逆向启动标记无法同时兼顾投射特异性和细胞类型特异性标记，且由于逆向启动标记的犬腺病毒CAV和RetroAAV病毒或者其它病毒均存在感染神经元细胞类型偏好性或者毒性等问题[12]，因此被标记的神经细胞类型、荧光亮度以及完整细胞形态都会受到一定影响。