[发明专利]微滴式数字PCR隐匿性乙肝病毒检测试剂盒

说明书

本发明提供一种微滴式数字PCR隐匿性乙肝病毒检测试剂盒，其试剂盒包括数字PCR反应液、引物探针组合，所述引物探针组合选自S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合中的至少一种。本发明通过在乙肝病毒S、C保守序列分别设计引物探针，运用双重双基因数字PCR技术对HBV DNA进行同管同时检测，操作简便，快速，提高隐匿性乙肝病毒检测方法的灵敏度、特异性，尽可能的降低因突变导致假阴性结果发生的几率，并且能进一步提高检测效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种双重双基因同管微滴式数字PCR病毒检测方法及试剂盒。

背景技术

HBV感染仍然是全球面临的重大公共卫生问题。乙肝病毒感染自被发现以来，一直受到较大关注，尤其是近些年来，乙肝病毒感染潜在的临床危害越来越受到重视，全球感染HBV的总人数曾高达20亿，慢性HBV感染大大增加了肝硬化、原发性肝癌及肝衰竭的风险，每年约有100万人死于与HBV感染相关的疾病。在中国、印度、韩国、新加坡和越南等亚洲国家，80-90％的肝癌患者由HBV感染引起，据统计，到2030年，我国将有约1千万人死于的慢性乙肝病毒感染。乙肝病毒感染给患者及社会带来了沉重的负担。

一般临床上通过检测血液中的病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)来判断是否存在HBV感染，然而，随着分子检测技术的发展，上世纪80年代首次发现HBsAg阴性个体中也可能存在(Hepatitis B Virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA)，这种特殊形式的慢性乙肝病毒感染被称为隐匿性乙型肝炎病毒感染(Occut HBV infection，OBI)。

近年来随着研究的深入，OBI的临床危害越来越突出。有不少研究发现，隐匿性乙肝病毒感染与慢性肝脏疾病，肝硬化，肝细胞癌(HCC)等密切相关；隐匿性乙肝病毒可以通过输血，器官移植等方式传播；并且OBI患者如果接受免疫抑制治疗，发生乙肝病毒再激活的风险也会随之增大，所以对OBI患者进行及时准确的检测特别重要。

迄今为止，HBV DNA检测有很大进展，但是OBI检测，尚无标准、有效、统一的方法。欧洲肝脏研究协会(European Association for the Study of the Liver,EASL)在2007年将巢式PCR(nested PCR)技术作为OBI诊断标准：从患者肝组织或血清/血浆样本中提取核酸，使用多组特异性引物对HBV不同基因序列进行扩增检测，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳观察，当结果至少出现两个不同基因片段扩增阳性(≥2)，提示可能存在OBI。然而。巢式PCR技术：①操作繁琐，复杂，费时费力；②需要多对引物进行多次PCR扩增反应，增加污染的机会，并且需要的较大样本量；③扩增结果只能通过琼脂糖凝胶电泳进行定性分析。因此，巢式PCR技术并不适合OBI流行病学调查和临床的大规模推广使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双重双基因同管数字微滴式PCR病毒检测方法及试剂盒，用于解决现有技术中低载量HBV感染和HBV发生碱基突变，造成对OBI检测不准确，甚至出现假阴性的结果等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种双重双基因微滴式数字PCR乙肝病毒定量检测试剂盒，包括数字PCR反应液、引物探针组合，所述引物探针组合选自S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合中的至少一种，所述S基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合S1：

含有如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：TGCCCGTTTGTCCTCTAATTCC(SEQ IDNO.1)；

含有如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物：AGGTGCAGTTTCCATCCATAGG(SEQ IDNO.2)；