[发明专利]一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法

说明书

本发明涉及一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法，涉及微生物高通量测序领域。该方法首先将随机碱基组成的特异性标签序列(UMI)加在每个16S rDNA模板分子两端，经PCR扩增得到多个拷贝的两端含特定UMI的16S rDNA全长扩增子，通过随机打断并连接上测序文库的接头，经双端测序获得UMI序列和相应的16S rDNA片段序列；另外，通过环化16S rDNA全长扩增子和测序，获得同一分子两端的UMI配对信息；根据相同UMI和配对UMI信息进行reads的组装，从而增加拼接长度，最终组装得到16S rDNA全长序列信息。本发明提供的方法成本低、准确度高，适用于高通量测序平台；同时该方法通过UMI可有效排除PCR扩增偏好性、扩增错误和测序错误的影响，从而更加精确地定量样本中的细菌种群丰度。

技术领域

本发明属于微生物基因高通量测序领域，具体涉及一种用于构建细菌16SrDNA全长高通量测序文库的方法。

背景技术

16S核糖体核糖核酸(ribosomal RNA,rRNA)为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA是编码该亚基的基因，存在于所有细菌基因组中，长度约为1.5Kb，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rDNA包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rDNA常用于研究特定环境中的物种信息，包括物种差异、物种分类和物种丰度等，对复杂环境中的微生物构成研究有重要的指导作用。几十年来，16S rDNA已被广泛应用于分类学和系统发育关系的确定。

16S扩增子测序即通过提取环境样品的基因组DNA，选择合适的通用引物扩增16SrDNA某一或某几个区，通过测序检测目的区域的序列变异和丰度，对环境样本的物种分类、丰度、种群结构、系统进化、群落比较等信息进行分析的研究方法。

16S rDNA在细菌的基因组中存在多个拷贝，不同属的16S rDNA拷贝数不同，同一个属内有些种的16S rDNA拷贝数也可能存在差异。DNA的提取、引物的选择、PCR扩增以及测序方法的不同都可能会影响最终结果的偏好性。比如，在使用同一对引物扩增16s基因的可变区域时，无法保证对不同细菌16S rDNA序列的扩增效率是一致的。如果第一轮扩增对目标片段有些微偏好性，第二轮扩增时会指数式放大PCR对片段的扩增偏好性。这种扩增偏好性可能导致分析结果偏离真实的微生物种群的组成。尽管二代测序的错误率很低(例如，Illumina的错误率约0.1％)，但测序错误仍然会导致一些不真实的序列多样性。因此，如何能够在测序结果中排除扩增错误和测序错误，直接反应出样本中原始模板分子的基因序列尤为重要。

DNA测序技术的进步使我们能够更好的研究不同环境下的复杂微生物的动态组成，但由于目前高通量测序平台读长的限制，只能对16S rDNA的某一段可变区进行测序，常见的有测单V区(V3/V4/V6)、测双V区(V3-V4区或V4-V5区)或测三V区(V1-V3区、V5-V7区或V7-V9区)。但全长测序更有优势，目前16SrDNA全长的测序主要采用三代测序，如Pacbio平台测序，其优点是读长较长，可以获取16S rDNA全长的序列信息，缺点是测序成本高且通量小。

因此，现有的细菌16S rDNA全长的建库测序方法仍需进一步改进，以便适用于多种高通量测序平台，如HiSeq X Ten、HiSeq4000、NextSeq500等，以有效降低测序成本；此外也需要尽量排除PCR扩增偏好性、扩增错误和测序错误的影响，更加精确地定量细菌种群丰度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法，可以适用于多种高通量测序平台，能有效降低测序成本，同时可有效去除PCR扩增偏好性、扩增错误和测序错误的影响，更加精确地定量细菌种群丰度。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：