[发明专利]一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法

说明书

本发明公开了一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法，该方法以川芎咖啡酸‑O‑甲基转移酶为催化剂，以咖啡酸甲酯和S‑腺苷甲硫氨酸为反应物，再加入缓冲液、还原剂配置成反应体系，制得阿魏酸甲酯。本发明提供的酶法合成阿魏酸甲酯的方法，以咖啡酸甲基转移酶为催化剂、以咖啡酸甲酯和S‑腺苷甲硫氨酸为反应物制备阿魏酸甲酯，生产工艺步骤少，反应条件温和，绿色环保。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法。

背景技术

阿魏酸甲酯是一种紫外吸收剂，其对280nm～360nm波长的紫外线有良好的吸收能力且吸收率高，具有抗氧化、美白与消炎等功效。比如，在化妆品加入阿魏酸甲酯，不仅能够起到美白作用，长期使用还能够使皮肤具有绢质感。并且，阿魏酸甲酯还可作为强效美白剂阿魏酸异辛酯的合成中间体。最后，阿魏酸甲酯也是一个重要的医葯中间体。

目前阿魏酸甲酯的合成方法主要有以下几种。第一种是Knoevenagel两步法工艺：即第1步，香兰素与丙二酸经Knoevenagel缩合反应制得阿魏酸；第2步，阿魏酸与甲醇酯化反应得到阿魏酸甲酯。其中Knoevenagel缩合常用吡啶作溶剂，哌啶作催化剂，毒性较大。该方法缺点是步骤多，所有试剂如吡啶、甲醇毒性较大。

酯化方法包括酰氯法、DCC法、酸催化法等，这些方法或者使用毒性大的试剂，或者收率较低。

亦有文献报道采用“一锅合成法”和“微波辅助阳离子交换树脂催化法”合成阿魏酸甲酯的方法。其中，“一锅合成法”以香兰素、丙二酸二乙酯为主要原料，以甘氨酸为催化剂,无水甲醇为溶剂，经水解、酸化和Knoevenagel缩合等反应一锅式合成了阿魏酸甲酯。该方法缺点是转化率低，步骤多，所用试剂毒性大、污染环境。“微波辅助阳离子交换树脂催化法”以甲醇和阿魏酸为原料，以强酸性阳离子交换树脂为催化剂，在微波辐射下合成阿魏酸甲酯。该方法缺点是甲醇毒性大且污染环境)。总结现有的阿魏酸甲酯制备方法，均是利用有机合成的方法，存在生产工艺步骤较多、毒性大与污染严重等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简单、反应条件温和、环境友好且转化效率较高的生物催化剂(酶法)合成阿魏酸甲酯的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法，以咖啡酸-O-甲基转移酶为催化剂，以咖啡酸甲酯和S-腺苷甲硫氨酸为反应物，再加入缓冲液、还原剂配置成反应体系，制得阿魏酸甲酯；

上述过程反应式表示为：

本技术方案利用高纯度的咖啡酸-O-甲基转移酶(Caffeic acid O-methyltransferase，以下均缩写为COMT)为催化剂，以咖啡酸甲酯和S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，以下均缩写为SAM)为反应物，“一步反应”生成阿魏酸甲酯和S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，以下均缩写为SAH)；

上述酶法合成阿魏酸甲酯的方法中，COMT优选课题组通过基因工程方法制备的川芎咖啡酸-O-甲基转移酶(Ligusticum chuanxiong caffeic acid O-methyltransferase，以下均缩写为LcCOMT)。COMT属于O-甲基转移酶(OMT)家族成员，是植物苯丙烷类化合物，如类黄酮与木质素生物合成途径中的关键酶，其甲基基团的供体是SAM。目前尚未有研究报道COMT能够催化咖啡酸甲酯形成阿魏酸甲酯。因此，以LcCOMT为催化剂，催化咖啡酸甲酯与SAM反应形成阿魏酸甲酯，是保证本发明得以实施的关键技术点，也是本发明的重要创新点之一。

本发明中使用的LcCOMT为本课题组采用基因工程方法制备，包括将LcCOMT基因转入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达及纯化LcCOMT等方法，具体步骤如下：

S1、制备LcCOMT：