[发明专利]一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体，其特征在于：所述miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括分别与miR-135a-5p种子序列结合的两处野生型位点片段，第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段，第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。

2.根据权利要求1所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体，其特征在于：所述两处野生型位点片段的引物序列分别是：5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；以及，5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d；

第一个突变位点片段的引物序列是：

5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'，记为引物b1；

5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'，记为引物c1；

第二个突变位点片段的引物序列是：

5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'，记为引物b2；

5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'，记为引物c2。

3.一种如权利要求2所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：

1)构建野生型荧光载体；

2)以步骤1)构建得到的野生型荧光载体为模板，分别构建带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段；

3)将步骤2)构建得到的带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段分别进行搭桥，形成整体片段；

4)以步骤3)得到的整体片段为模板，分别进行PCR扩增；

5)将经过步骤4)后的产物连接pMD-18T载体，经过转化、提取质粒、双酶切，连接psiCHECK-2荧光载体，挑选阳性质粒，所述阳性质粒的第一个突变位点、第二个突变位点以及两个突变位点都成功突变。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：将野生型位点片段的引物序列进行PCR扩增制备双链DNA，将双链DNA与pMD-18T载体连接，转化感受态细胞、提取质粒、双酶切，将酶切片段与psiCHECK-2荧光载体连接，得到野生型荧光载体；所述野生型位点片段的引物序列是5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中构建带有第一个突变位点的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物a和引物b1为引物扩增带有第一个突变位点的载体片段ab1；

所述引物a的序列是5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'；

所述引物b1的序列是5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'；

所述步骤2)中带有第二个突变位点的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物c2和引物d为引物扩增带有第二个突变位点的载体片段c2d；

所述引物c2的序列是5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'；

所述引物d的序列是5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'；

所述步骤2)中第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物c1和引物b2为引物扩增第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段c1b2；

所述引物c1的序列是5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'；

所述引物b2的序列是5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'。