[发明专利]一种病毒纯化的方法、制备的疫苗组合物及其应用

说明书

本发明提供了一种病毒抗原的纯化方法，该纯化方法包括：中速离心去除增殖的病毒液中的大分子杂质，用核酸酶处理去除大分子杂质后的病毒液，加入EDTA抑制核酸酶，用凝胶层析进行纯化分离，以获得纯化的病毒抗原。本发明的方法制备的抗原在相同TCID₅₀含量时产生的中和抗体效价较经纯化的灭活抗原更高，具有良好的免疫原性。

技术领域

本发明涉及病毒的纯化领域以及制备的含病毒的医药配制品领域，特别是涉及病毒纯化的方法、及其制备的疫苗组合物。

背景技术

病毒抗原的纯化是研究及生产中的一个关键步骤。为了去除培养过程中的杂质，一个好的病毒抗原纯化工艺应该能有效去除各种培养过程中带来的杂蛋白、核酸及其他杂质，并且具有很好的抗原回收率。

传统的病毒类疫苗纯化采用密度梯度超速离心工艺，该工艺需要价格昂贵的超速离心机，制备疫苗的成本高昂；过大的离心力和梯度溶液的高渗透性极易损伤病毒的活性及完整性，而且一次处理的样品量受到限制，为疫苗的产业化带来困难。

凝胶过滤柱层析纯化技术虽然能得到较为纯净的病毒抗原，但病毒抗原在培养过程中带来的杂质直接影响着病毒抗原的收率，同时，宿主细胞的破碎、病变、坏死或凋亡产生的部分核酸分子量与病毒粒子非常相近，直接影响病毒抗原的纯度。

因此，开发一种纯化技术路线简洁、分离效率高、分离选择性好、对病毒结构破坏性小的病毒纯化方法具有非常重要的意义。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种病毒的纯化方法，该方法可以进行大规模病毒纯化，获得高纯度、高滴度的病毒，降低成本投入。

本发明提供了一种病毒抗原的纯化方法，其中，所述纯化方法包括以下步骤：步骤(1)中速离心去除增殖的病毒液中的大分子杂质；步骤(2)用核酸酶处理所述步骤(1)获得的所述去除了大分子杂质后的病毒液，以降解宿主细胞的核酸；步骤(3)将所述步骤(2)核酸酶处理后的病毒液加入EDTA抑制核酸酶；以及步骤(4)用凝胶层析对所述步骤(3)的所述抑制了的核酸酶的病毒液进行纯化分离，以获得纯化的病毒抗原。

本发明的纯化方法，其纯化的病毒抗原在更大程度上保留了抗原的免疫原性，其制备的灭活疫苗其免疫原性与未经纯化处理的病毒抗原相当。

本发明病毒纯化方法去除大分子杂质的处理工艺采用中速离心方式，要求低，处理条件温和，不会对病毒颗粒造成二次破坏，同时具有处理量大，处理成本低的特点；本发明病毒纯化方法采用核酸酶处理病毒液，不仅提升病毒的纯度，而且显著增加后期纯化病毒的收率；本发明病毒纯化方法采用EDTA中和核酸酶，避免对目的病毒结构造成持续破坏，最大程度保证了病毒抗原的免疫原性；本发明病毒纯化方法可以处理多种病毒抗原，具有广泛的适用性。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(1)中所述增殖的病毒液经浓缩前置处理。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(1)中所述中速离心的离心速率为7000rpm～9000rpm，所述离心时间为10min～20min。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述中速离心的离心速率为8000rpm，所述离心时间为12min。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(2)中所述核酸酶为Benzonase核酸酶，所述核酸酶添加量为1.5～2U/mL，所述核酸酶处理时间为30min。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述核酸酶添加量为1.8U/mL。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(3)中EDTA浓度2mmol/L。

本发明还提供了所述的纯化方法得到的病毒抗原。