[发明专利]一种硫酸软骨素酶的筛选，鉴定及优化表达

说明书

本发明公开了一种硫酸软骨素酶的筛选，鉴定及优化表达，属于生物工程技术领域。本发明从自然界中筛选鉴定出一种硫酸软骨素酶，其氨基酸序列与NCBI报道的硫酸软骨素酶最高相似度为85％，然后在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中优化表达，实现了高酶活的硫酸软骨素酶高效生物合成，其最高酶活为11976.5U/L，而且整个工艺和后处理相对更简单。本发明为在医药、化妆品、生物领域制备含低分子量硫酸软骨素的产品中具有潜在而广泛的应用价值，为微生物系统高效发酵制备高酶活的硫酸软骨素酶奠定了基础，适合于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种硫酸软骨素酶的筛选，鉴定及优化表达，属于生物工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素酶(Chondrosulphatase，简称ChSase)是能够将硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸等糖胺聚糖降解成不饱和二糖及寡糖的1种裂解酶。ChSase根据其作用底物的不同分为ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等。硫酸软骨素酶在生物化工及医药领域具有重要的应用价值，在基础研究中，它可以作为工具酶，用于硫酸软骨素质量研究和高效制备具有多种生物活性的硫酸软骨素低聚糖；在医药上，硫酸软骨素酶做为药用酶，具有降解囊性纤维变性部位的黏液、促进神经轴的再生、减轻腰椎间盘突出的症状、抗肿瘤和增强软骨细胞与软骨之间的黏附力等多种药用功能。硫酸软骨素酶主要来源于微生物，且多为裂解酶，肝素黄杆菌、彭氏变形杆菌和温和气单孢菌、普通变形杆菌等均可产硫酸软骨素裂解酶。然而大多数微生物来源的硫酸软骨素裂解酶为胞内酶且酶活力较低。陶科等人(硫酸软骨素裂解酶ABC产生菌的筛选及发酵工艺研究[J].中国抗生素杂志,2004,(29)3:138-140.)曾报道过利用一株彭氏变形杆菌发酵生产ChSase，该过程工艺较为复杂，而且在发酵后期，ChSase的酶活下降较为明显，整个过程的最高酶活仅为322.17U/L。苏昕等人(发酵法制备硫酸软骨素裂解酶及其酶分离纯化的研究[J].微生物学杂志,2005,(25)4:64-67.)报道了从鱼腹中筛选得到的一株温和气单孢菌，虽然其产酶能力较高，但是需要经过1步透析和4步柱层析的纯化工艺，过程较为复杂，成本较高，不利于工业放大。除了发酵来源微生物进行产酶，Li等人(Expression,purification and characterization ofGAPDH-ChSase ABC I from Proteus vulgaris in Escherichia coli[J].ProteinExpression and Purification,2016,(128):36-41.)也报道了将来源于变形杆菌的ChSase在大肠杆菌中进行异源表达，为提高ChSase的表达量，报道中共表达了甘油醛-3-磷酸脱氢酶，但是纯化后的酶活却降低了3.1倍，因此不利于工业放大。目前国内没有产品供应，几乎全部依靠进口，价格非常昂贵，限制了硫酸软骨素酶在制备低分子硫酸软骨素和医药方面的应用，因此，筛选高酶活的硫酸软骨素酶具有重要的意义。

发明内容

本发明从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂等处采集土样，污水或淤泥进行筛选，鉴定出一种硫酸软骨素酶。取适量土样，用生理盐水浸提，经富集培养后，梯度稀释涂筛选平板，比较并挑选透明圈与菌株直径比值最大的菌落，将该菌落接种到液体发酵培养基中培养并提取菌群基因组进行宏基因组测序，分析并筛选出硫酸软骨素酶可能性最高的序列，然后人工合成该序列并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进一步鉴定与优化表达，所用表达载体为质粒pBRSFDuet-1、pHT01、pHT43-His、pMA5或pWB980。本发明从自然界中筛选鉴定出一种硫酸软骨素酶，其氨基酸序列与NCBI(全称National Center of BiotechnologyInformation)报道的已知硫酸软骨素酶最高相似度为85％，然后在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中优化表达，实现了高酶活的硫酸软骨素酶高效生物合成，其最高酶活为11976.5U/L。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素酶从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂等处采集土样，污水或淤泥进行筛选，鉴定得到的其氨基酸序列与NCBI报道的硫酸软骨素酶最高相似度为85％。