[发明专利]一种从发酵液中提取银耳多糖的方法

说明书

本发明提供了一种从发酵液中提取银耳多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：将发酵液进行冻融处理3～5次，使得发酵液分层，银耳芽孢破碎，离心，所得上清液为银耳胞内多糖与胞外多糖混合液；向银耳胞内多糖与胞外多糖混合液中按体积比1:1～5加入无水乙醇/碳酸钾双水相体系，搅拌10～30min混匀后，静置5～15min分相；将无机盐下相离心分离，取上清液，采用截留分子量为7000～14000Dal的透析袋透析2～4天，截留液经冷冻干燥后，制得银耳多糖。本发明蛋白清除率高，多糖保留率高。

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中提取银耳多糖的方法，特别涉及采用冻融法结合双水相萃取体系提取银耳多糖并分离蛋白，属于生物工程技术领域。

背景技术

银耳(Tremella fuciformis Berk)是一种名贵的食药两用菌，从古至今，在我国作为补品被广泛使用。现代科学证明，银耳多糖作为银耳中的主要活性物质，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖和降血脂等多种生理功能；同时还具有滋阴、保湿等润肤功效。银耳多糖可以作为天然活性成分应用于功能性食品添加剂、医药保健品、日用化妆品等领域，且通过发酵制备银耳多糖可以保证广阔稳定的原料来源，发酵银耳多糖具有广泛的开发应用前景。

银耳多糖一般从子实体中提取获得，但银耳子实体培养周期长、产量低、易受气候影响不易规模化生产，为了克服这些缺点可以用液体发酵法培养银耳芽孢产生银耳多糖，发酵法获得银耳多糖成本低、发酵周期短、可一次大量获得品质稳定的银耳多糖。

从银耳子实体或孢子中提取银耳多糖的方法主要有热水浸提法、水提醇沉法、酶溶提取法、超声辅助提取法等，通过上述方法获得的粗多糖中纯度低，往往含有大量蛋白质等杂质，为提高多糖纯度，还需要再采用sevag法除去多糖中的蛋白质。上述提取纯化过程提取效率低，会损失大量多糖，且具有有机试剂残留，有毒有害不环保、能耗高成本高等问题。

冻融法是用物理方法破碎芽孢，去除蛋白和破碎的菌体等杂质，操作简单，过程中不引入有机试剂，多糖保留率高。双水相萃取技术是近年来发展起来的生物分离技术，利用有机试剂和盐溶液混合后，静置后分层产生两液相系统，再体系中对多糖进行选择性分配。双水相萃取具有操作条件温和、分离步骤简单、能耗低，无有机溶剂残留，易于工业化操作等优点。

冻融法结合双水相法从发酵液中提取银耳多糖的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、多糖收率高、成本低、绿色安全、便于规模化生产的银耳多糖提取方法。

本发明的方法是利用冻融法结合双水相体系提取银耳多糖，从而提高提取效率、降低生产成本、降低提取过程风险，以实现银耳多糖工业化制备。

本发明采取的具体技术方案如下：

一种从发酵液中提取银耳多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将银耳芽孢菌接种到斜面培养基上，在24～30℃下活化培养1～2天，然后将银耳孢子接入到液体种子培养基中，在150～200r/min、24～28℃下培养1～2天，制得液体种子；将液体种子按2～10wt％的接种量接入液体发酵培养基中，在温度24～28℃、200～250r/min条件下，培养2～4天，制得发酵液；

步骤2：将步骤1制得的发酵液进行冻融处理3～5次，使得发酵液分层，银耳芽孢破碎，离心，所得上清液为银耳胞内多糖与胞外多糖混合液；

步骤3：在室温下配制双水相溶液，以碳酸钾为无机相，乙醇为有机相，在总体系中无机相质量百分比浓度为10～30％，有机相在总体系中的质量百分比浓度为10％～30％，其余为水，混合均匀，制得乙醇/碳酸钾双水相体系；

步骤4：向步骤2制得的银耳胞内多糖与胞外多糖混合液中按体积比1:1～5加入步骤3制得的无水乙醇/碳酸钾双水相体系，搅拌10～30min混匀后，静置5～15min分相；