[发明专利]一种胆固醇酯酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种胆固醇酯酶的制备方法，属于酶工程技术领域。本发明中的胆固醇酯酶是利用保藏编号为CCTCC NO:M2017661的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ZWS15进行制备得到。该酶具有良好的酸碱稳定性和温度稳定性，70℃下2小时酶活残留量还有70％，且能够耐受5％的高浓度的表面活性剂，和50％高浓度的有机溶剂。本发明制备得到的胆固醇酯酶对胆固醇苯甲酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯、胆固醇辛酸酯的胆固醇酯酶活力分别高达415U/L、1038U/L、996U/L、294U/L。且能够降解三酰基甘油酯及对硝基苯酯类底物。

技术领域

本发明涉及一种胆固醇酯酶的制备方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

胆固醇酯酶(EC 3.1.1.13)，主要作用于水溶性介质中的胆固醇酯，使其水解为胆固醇和脂肪酸。其广泛存在于哺乳动物组织和微生物体中，相较于哺乳动物来源酶的产量低、纯化复杂、性质不理想等缺陷，微生物来源的胆固醇酯酶生产成本低，较动物来源胆固醇酯酶具有更广泛的作用pH与作用温度，显示出更高的稳定性和底物特异性，因此逐渐成为研究热点。

胆固醇酯酶因其与人体脂质代谢及胆固醇吸收有关，通常作为检测用酶用于检测血液中总胆固醇含量；另外胆固醇酯酶在食品、污水处理、制浆造纸工业、皮革织物脱脂等领域也有广阔的应用前景。在后几种场合应用到的酶在大多数情况下需要宽泛的底物特异性、较高的温度耐受性和有机溶剂耐受性，如制浆造纸工业中处理温度一般为60℃～80℃。

胆固醇酯酶是酯酶的一种，属于α/β水解酶家族中的酯类水解酶(EC 3.1.1.X)，该类酶中还包括了脂肪酶(EC 3.1.1.3)。胆固醇酯酶和脂肪酶最大的区别在其水解底物种类不同，脂肪酶主要作用于长链脂肪酸形成的酯键，胆固醇酯酶主要作用于短链脂肪酸形成的酯键，而少部分胆固醇酯酶也可以水解脂肪酶的底物。

Smirnov等人在1980年提出胆固醇酯酶可以分为两大类，一类特异性水解胆固醇酯类物质，如荧光假单胞来源的胆固醇酯酶对长链胆固醇酯具有显著偏好性，来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200的胆固醇酯酶对芳香脂类底物具有高度特异性；另一类在降解胆固醇酯类底物的同时具有解脂能力(即可以水解脂肪酶的底物)，如链霉菌X9来源的胆固醇酯酶也可以降解三油酸甘油酯，来源于Ophiostoma piceae的还可以有效的降解三丁酸甘油酯。

除水解底物种类宽泛外，研究表明部分胆固醇酯酶对有机溶剂和表面活性剂也具有显著耐受性。Takeda等从洋葱伯克霍尔德菌ST-200中获得胆固醇酯酶，其具有较好的温度耐受性(4℃～65℃)，在20％甲醇存在下，酶活能够提高到7.2倍；Sintawee等发现来自铜绿假单胞菌的胆固醇酯酶在37℃下放置28天后仍能残留70％的酶活；Hanna从Melanocarpus albomyces中纯化出一种胆固醇酯酶，在5％曲拉通X-100的存在下。但是，目前大部分研究仅侧重于胆固醇酯酶对亲水性有机溶剂的耐受性，而对胆固醇酯酶对疏水性有机溶剂的耐受性现有报导，且耐受的有机溶剂浓度较低，耐受的温度仍然不足以满足工业上的需求。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种耐高温、耐有机溶剂的胆固醇酯酶的制备方法，利用本发明的方法制备得到的胆固醇酯酶，具有水解底物种类多，对高温、亲水性和疏水性有机溶剂和表面活性剂耐受性能好，适用于食品、污水处理、制浆造纸工业、织物脱脂等领域中，为其进一步工业化应用提供参考与借鉴。

本发明的第一个目的是提供一种耐高温、耐有机溶剂的胆固醇酯酶的制备方法，是利用保藏编号为CCTCC NO:M2017661的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ZWS15进行制备生产。

在本发明的一种实施方式中，所述制备是使用胆固醇酯类作为诱导物，在含有曲拉通X-100的发酵培养基中诱导洋葱伯克霍尔德菌ZWS15进行发酵生产。