[发明专利]转基因油菜品系Topas19-2检测方法和试剂

说明书

本申请公开了一种转基因油菜品系Topas19‑2检测方法和试剂。本申请的检测方法，包括在PCR反应体系中同时加入油菜品系Topas19‑2外源基因和PEP基因的特异引物和探针，并加入矿物油，混匀制成微滴，在微滴中进行双重ddPCR，反应结束后，读取每个微滴扩增信号，计算品系外源基因和PEP的拷贝数；其中，品系外源基因和PEP基因的探针分别用FAM和HEX标记。本申请检测方法，设计配套使用的内源基因PEP和品系特异性引物探针，采用双通道法，分别定量出两者在油菜基因组中的拷贝数，计算转基因油菜品系Topas19‑2绝对含量，对油菜转基因成分研究和进出境油菜产品中转基因成分精准定量检测有重要意义。

技术领域

本申请涉及转基因油菜检测领域，特别是涉及一种转基因油菜品系Topas19-2检测方法和试剂。

背景技术

随着生物技术产业的迅速发展，全球转基因作物的研发速度和种植面积持续增加。推进转基因技术已经成为了着眼于未来的发展战略和解决粮食短缺、确保国家粮食安全的必然选择。但是转基因生物安全问题也随之成为世界关注的热点。目前世界各国出于经济、卫生、环保等各种目的纷纷对转基因生物及其产品加强管理和检测。包括中国在内的50个左右国家和地区相继颁布并实行了“转基因标识制度”，对转基因生物及其加工产品进行标识和管理。近年来，随着各国有关GMO(GeneticallyModified organism)标签法的建立和不断完善，对食品中的GMO含量下限已有所规定。很多国家不但要求对转基因食品进行定性检测，还需要对食品中的GMO含量进行定量检测，以便标识。其标识的阈值一般在0.9％–5％之间(European Commission,2003；Notification,2000)。建立转基因产品的检测技术标准尤其是精准定量检测技术是实施转基因产品标识的技术前提。因此，转基因成分的精准定量技术将随着全世界标识制度的完善和发展日趋重要。

现阶段应用最广的定量检测方法是实时荧光PCR(qPCR)，但稳定性、准确性差，所以需要更加精准的检测方法进行替代。数字PCR(dPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因定量技术，用于核酸的绝对拷贝数检测。dPCR通过将常规的荧光PCR反应体系等量均分为相互隔离的大数量微反应体系，通常等量均分为10000个以上的微反应体系，使每个模板独立随机分配至微反应体系中，同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应，根据设定的荧光值判断每个微反应体系的检测结果。最后以实验的阳性与阴性结果的比率进行泊松分布分析，获得荧光PCR反应体系中的模板浓度。与传统qPCR相比，dPCR存在有以下优势:(1)qPCR结果判定依赖扩增曲线的Ct值，容易受到外界影响；而dPCR结果判定不依赖于扩增曲线，只需要判定扩增信号的有无，就可以对样品进行判定，稳定性远强于qPCR；(2)qPCR容易受到基质中抑制因子的影响；而dPCR通过将反应体系进行分割，可以弱化PCR抑制因子对反应结果的影响，从而提高结果判定的稳定性和准确性。

目前，数字PCR(dPCR)在科学研究方面已经取得了很大的研究进展，其在临床诊断、拷贝数鉴定、绝对定量等方面取得了很多科研成果。Taly等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)技术检测直肠癌病人环状DNA的KRAS突变基因，最终实现了包括野生型的多重样品检测。在植物源制品的检测研究中，Corbisier等(2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内标准基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR的可靠性。Burns等(2010)评估了数字PCR的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了数字PCR在检测方面的可行性和反应条件，文章表明数字PCR能够对起始模板拷贝数进行绝对定量。Morisset等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)检测转基因玉米MON810含量，获得了和定量PCR一致的结果，该结果也间接证明了dPCR技术对于转基因定量检测的贡献。总体而言，dPCR技术目前更多地应用于医学诊断方面，已成为临床应用方面最具潜力的诊断技术之一，并在其它行业取得了突破性研究进展。但是，在转基因检测的研究方面，数字PCR还处于起始阶段，特别是在我国乃至全球各国的标准层面都暂无涉及，这极大制约了数字PCR在实际检测工作上的应用。