[发明专利]一种胆固醇氧化酶及其应用

说明书

本发明公开了一种胆固醇氧化酶及其应用，属于酶工程技术领域。本发明首先构建得到胆固醇氧化酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)‑pET20b(+)‑COD，其发酵所得的粗酶液中胆固醇氧化酶酶活高达700U·L^‑1，纯化得到的胆固醇氧化酶比酶活为18.5U·mg^‑1，其分子量约60,000kDa，该胆固醇氧化酶具有良好的温度耐受性和有机溶剂耐受性。利用工程菌发酵液制备胆甾‑4‑烯‑3‑酮和胆甾‑4‑烯‑3,6‑二酮，在有机相为甲苯的两相转化体系中，以胆固醇为底物制备胆甾‑4‑烯‑3‑酮的转化率为30％；制备胆甾‑4‑烯‑3,6‑二酮的转化率为45％。

技术领域

本发明涉及一种胆固醇氧化酶及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase；EC1.1.3.6；COD)属于黄素氧化酶类，能特异性氧化含3β-OH的类固醇底物。胆固醇氧化酶具有重要医学检测价值，可用于定量血样胆固醇的含量，如动脉粥样硬化性疾病需评估高密度脂蛋白或低密度脂蛋白的含量，以及评估血栓形成的风险等，而将胆固醇氧化酶固定在膜上采用电化学生物传感器测定胆固醇的含量是最近研究的热潮；胆固醇氧化酶具有广泛的底物特异性，可以转化大量的3β-羟甾类化合物，为工业类固醇药物甾体激素或甾体类药物的合成生产提供有用的中间体。

甾醇的5-烯-3-酮衍生物、4-烯-3-酮衍生物、4-烯-3,6-二酮衍生物都具有良好的脂质代谢改善功能，可作为减肥药，在治疗肝病、动脉粥样硬化及抗肥胖等方面具有显著疗效。甾醇的烯酮衍生物主要通过化学合成或天然产物提取获得。例如胆甾-4-烯-3,6-二酮是以胆固醇为原料，经过Jones试剂氧化或PCC/二氯甲烷法化学合成，或是来源于海洋天然产物提取物；豆甾-4-烯-3,6-二酮可由植物提取物中获得；胆甾-4-烯-3酮可利用微生物所产的胆固醇氧化酶以胆固醇或其衍生物为底物获得。

目前已报道的产胆固醇氧化酶的微生物菌株主要有以下属：诺卡氏菌属、假单胞菌属、短杆菌属、红球菌属、链霉菌属、节杆菌属、棒杆菌属和芽孢杆菌属等。因甾醇类物质不溶于水，尤其是在甾体药物的生物催化过程中，需要高温和高比例有机溶剂促溶剂的参与，对酶和微生物的温度耐受性、有机溶剂耐受性提出了较高要求。目前研究较多的生产该酶的菌株主要为革兰氏阳性菌，所产生的胆固醇氧化酶热稳定性和有机溶剂耐受性不佳且酶活力较低，无法达到工业上生产的需求。因此，如何获得温度耐受性和有机溶剂耐受性好且酶活力高的胆固醇氧化酶显得十分重要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种胆固醇氧化酶，所述胆固醇氧化酶含有下述氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.1所示；或者，

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有胆固醇氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供所述胆固醇氧化酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体、细胞、转化体。

本发明的第四个目的是提供一种产胆固醇氧化酶的重组菌，表达所述胆固醇氧化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以pET28a(+)为载体，以E.coli BL21(DE3)为宿主。

本发明的第五个目的是提供一种用于临床诊断的试剂盒，含有所述的胆固醇氧化酶。

本发明的第六个目的是提供一种生物杀虫剂，含有所述的胆固醇氧化酶。

本发明的第七个目的是提供一种食品中的脂质代谢改善剂，含有所述的胆固醇氧化酶。

本发明的第八个目的是提供一种生产所述胆固醇氧化酶的方法，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。