[发明专利]一种基于单分子荧光成像的细胞内miRNA定量方法

说明书

本发明公开了一种细胞内miRNA定量方法。所述方法包括如下步骤：(1)离体的细胞经固定后进行细胞核染色；(2)向细胞中加入含有荧光探针的缓冲液，荧光探针与细胞内待检测miRNA发生可逆结合；(3)将细胞置于TIRF显微镜的载物台上进行检测，在明场下记录细胞形态，在宽场荧光记录细胞核位置，在HILO模式下记录单分子荧光强度‑时间轨迹；(4)通过信号过滤，获得单分子荧光强度‑时间轨迹呈现ON‑OFF交替变化的单分子成像图，即为所述细胞内miRNA单分子成像图，经计数即得到细胞内miRNA的数量。本发明提供了一种“原位定量成像”的方式，利用高辨识度的单分子动力学指纹信号，对细胞内miRNA进行单分子定位与精准计数，突破胞内miRNA定量依赖于RNA提取的技术瓶颈。

技术领域

本发明涉及一种miRNA细胞成像方法，具体涉及一种基于单分子荧光成像的细胞内miRNA定量方法，属于目标物成像与检测领域。

背景技术

microRNA(miRNA)是具有22个核苷酸的非编码RNA。miRNA通过结合mRNA调控基因表达，几乎参与所有细胞途径，包括分化、代谢、凋亡、信号传导等。多项预临床研究表明肿瘤细胞中的多种miRNA含量与健康人存在差异，肿瘤发展的不同阶段，其含量也有所不同，miRNA有望成为新一代肿瘤早期诊断标志物。发展可靠的细胞内miRNA检测方法，实现细胞内miRNA的准确定量，一方面可以加速miRNA成为稳定可靠的临床诊断标志物，另一方面有助于生物学家深入探究miRNA代谢机制和生理功能。细胞内核酸检测技术一般分为两种：1)提取一定数量细胞内的核酸，然后利用体外检测技术对目标核酸进行定量；2)利用成像技术在原位对目标核酸进行检测。第一种方法需要较为复杂的核酸提取步骤，在这一过程中，可能导致miRNA的降解。另外，这种方式所检测的核酸数量是多细胞平均的结果，忽略了单细胞之间的差异。第二种方式是目前较为广泛使用的手段，成像方式以荧光成像为主，也包括拉曼成像等其他方式，但普通成像模式只能通过比较单位面积的信号强度获得相对表达量，难以对细胞内miRNA进行直接定量。

单分子成像技术可以提供超分辨的成像精度，选用合适的数据分析方法就可以在细胞内直接测定生物分子含量。全内反射荧光(Total internal reflectionfluorescence，TIRF)显微镜是单分子测量与成像的常用工具。当光线由高折射率介质进入低折射率介质，光会发射全内反射。全内反射的光波诱导产生的渐逝场(evanescentfield)在离开介质表面100nm的薄层后迅速衰减，从而大幅降低溶液的背景荧光，实现表面薄层内单个荧光分子的激发和探测。TIRF显微镜的高倾斜和层压光学片(highly inclinedand laminated optical sheet，HILO)模式采用高度倾斜的激光束，可以扫描样品体积，受限的照明体积带来了高对比度，同时在宽视场配置中保持深度扫描能力。HILO显微技术在细胞内单分子成像、超分辨成像领域有广泛的应用。在单分子检测中，通常利用标记荧光的探针探测被固定在成像平面的目标物分子，然后通过荧光计数进行定量。但是，细胞内环境较为复杂，干扰物质多，易造成探针的非特异性作用，导致假阳性信号。在单分子水平直接区分特异性分子识别和非特异性相互作用是提高单分子检测(成像)灵敏度的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞内miRNA定量方法，本发明基于单分子荧光成像，以单分子灵敏度识别miRNA，实现细胞内miRNA定量。

具体地，本发明所提供的细胞内miRNA定量方法，包括如下步骤：

(1)离体的细胞经固定后进行细胞核染色；

(2)向所述细胞中加入含有荧光探针的缓冲液，所述荧光探针与所述细胞内待检测miRNA发生可逆结合；

(3)将所述细胞置于TIRF显微镜的载物台上进行检测，在明场下记录细胞形态，在宽场荧光记录细胞核位置，在HILO模式下记录单分子荧光强度-时间轨迹；