[发明专利]一种酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂组H1和H2，所述试剂组H1包括肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化氢酶、色原、缓冲液、聚乙二醇、复合稳定剂、防腐剂，具体组成为：

所述试剂组H2包括：肌酐酶、肌酸酶、过氧化物酶抑制剂、缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、氯化钠、防腐剂、4-氨基安替比林、TOOS、谷胱甘肽氧化酶、吐温20、蔗糖、防腐剂，具体组成为：

2.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述的肌氨酸氧化酶是由保藏号CGMCC No.17306的LYH18菌株制备的基因工程菌GLYH18制备。

3.根据权利要求2所述的肌氨酸氧化酶，其特征在于，制备方法为：

步骤一、获得目的序列

以芽孢杆菌CGMCC No.17306为出发菌株，检测全基因组，与现有肌氨酸氧化酶基因比对得到原始肌氨酸氧化酶基因，改造并全基因合成微生物来源肌氨酸氧化酶编码基因序列，如SEQ No.1所示，肌氨酸氧化酶编码的氨基酸序列如SEQ No.2所示；

所述的出发菌株的保藏信息为：一种海洋细菌LYH18菌株，为芽孢杆菌属Bacillussp.，该菌株已于2019年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC No.17306；

步骤二、克隆载体构建

将步骤(1)中经过改造后肌氨酸氧化酶基编码基因序列插入表达载体pET-28a(+)中，构建成表达载体，命名为载体SOX-pET；

步骤三、目的基因扩增

以SOX-pET为模板进行PCR扩增，PCR产物鉴定纯度和分子量的大小，PCR产物经DNA回收试剂盒回收；

步骤四、重组质粒的构建

PCR克隆菌株CGMCC No.17306的肌氨酸氧化酶基因，连接到pET28a(+)中构建重组质粒；

步骤五、重组菌株的构建

将步骤四获得的重组质粒导入到大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞中，使用LB/抗生素Kan(50ug/ul)，平板，50ul转化液涂布，37℃培养，培养18-24h，即为所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18；

步骤六、重组菌株GLYH18诱导产酶

将步骤五中所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18，进行阳性克隆诱导表达，进行表达；

(1)种培养

挑取基因工程菌GLYH18单菌落至2ml LB/Kan(50ug/μl)培养基中，150rpm，37℃培养18-24h，获得种培养菌液；

(2)主培养诱导

在平板中添加5ml LB/Kan(50ug/μl)培养基，添加种培养菌液100μl，150rpm，37℃培养至OD600nm值约为0.4-0.6，得到发酵液，发酵液中添加150mM IPTG33μl，IPTG最终浓度达到1mM，进行诱导，18℃表达20小时后获得菌液；

(3)蛋白质抽提

集菌后取OD值为2.0左右的菌体加入320μl PBS进行缓冲液悬浊，悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离，12000rpm×5min，离心后分别获得全蛋白、上清、沉淀，全蛋白即为粗酶液；

步骤七、肌氨酸氧化酶的纯化

(1)硫酸铵沉淀：向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到20％，4℃静置过夜后8000r·min^-1冷冻离心，去除杂蛋白，在上清液中继续加入硫酸铵，使其饱和度达到80％，4℃静置过夜后8000r·min^-1冷冻离心，弃去上清，将沉淀重悬于PBS缓冲液，缓冲液为pH7.4的50mmol/L磷酸盐缓冲液，将经过硫酸铵沉淀后的酶液装入透析袋中，用PBS缓冲液进行透析，每隔12h进行更换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全；

(2)透析：采用透析袋对样品透析来除去残留的硫酸铵，4℃条件下，对盐析后样品进行透析，不断更换透析液，直至在透析液中无SO₄^2-为止；

(3)超滤与层析：将透析后的样品加入超滤管离心，4℃下4000r/min离心10-20min，后保留上清液，进行Sephadex G-75凝胶过滤层析：将透析后的样品加入到用PBS缓冲液预平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱先用3倍柱床体积的PBS缓冲液洗脱，再用含0～1mol/L氯化钠的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，体积流量为1ml/min，每管收集6mL，经酶活力检测后收集有酶活组分，即为肌氨酸氧化酶纯品酶液。