[发明专利]一种抗小鼠肝炎病毒的小鼠及其制备方法有效
| 申请号： | 201910273305.2 | 申请日： | 2019-04-04 |
| 公开（公告）号： | CN110157704B | 公开（公告）日： | 2021-08-06 |
| 发明（设计）人： | 蔡卫斌;李慧;高赛飞;杨镇宇 | 申请（专利权）人： | 中山大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人： | 段卉 |
| 地址： | 510275 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 小鼠 肝炎 病毒 及其 制备 方法 | ||
1.一种抗小鼠肝炎病毒的小鼠的制备方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术和核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sgRNA位点，进行基因敲除，所述方法包括以下步骤：
S1.将核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示的引物退火、磷酸化后连接到线性化的CRISPR/Cas9载体上，得到重组载体；
S2.重组载体的sgRNA序列前添加T7启动子序列，并进行sgRNA的体外转录；
S3.选取3～4周的雌性小鼠，进行超排卵处理，并将其与7～8周的雄性小鼠交配，获得用于显微注射的胚胎；
S4.从雌鼠的输卵管取胚胎，sgRNA和Cas9 mRNA的混合溶液显微注射胚胎胞浆；
S5.显微注射后的胚胎至二细胞期，将显微注射后的胚胎移植到假孕小鼠；
S6.小鼠出生，得到F0代小鼠，鉴定F0代基因修饰的小鼠；
S7.将得到的F0代基因修饰的小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠，并鉴定F1代基因修饰的小鼠；
S8.将得到的F1代基因修饰的小鼠自交得到F2代小鼠，并鉴定纯合的F2代基因修饰的小鼠。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体为pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，使用BbsI内切酶对pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9进行线性化。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中的sgRNA使用浓度为25～100g/μL；步骤S4中的Cas9 mRNA使用浓度为30～100ng/μL。
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