[发明专利]工程化多肽及其在合成酪氨酸或酪氨酸衍生物中的应用

说明书

本发明为工程化多肽及其在合成酪氨酸或酪氨酸衍生物中的应用。为了解决当前L‑酪氨酸及其衍生物的生产工艺中存在的问题，本发明提供了一种高效的工程酶催化剂和经济的酶促反应解决方案。使用本发明方法制备的产物浓度高，反应条件温和，提纯方法简单，操作简便，且对环境友好，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种工程化多肽及其应用。

背景技术

L-酪氨酸是一种动物体内重要的营养必需氨基酸，可作为营养增补剂以及多肽类激素、抗生素等医药化工产品的制备原料，在食品、饲料、医药和化工等行业具有广泛应用。L-酪氨酸衍生物也具有重要的工业用途，比如左旋多巴(L-3-羟基酪氨酸，又称L-多巴)是一种重要的生物活性物质，能转化为多巴胺治疗帕金森综合症；3-氟-L-酪氨酸被广泛应用于生化研究，可用于制备修饰蛋白，研究酶的底物特异性，以及合成含氟标记物模拟代谢过程；3-甲氧基-L-酪氨酸可用于阿魏酸等物质的合成，是重要的药物中间体；氮杂酪氨酸具有重要的潜在药用价值。

目前，制备L-酪氨酸及L-多巴的方法主要有3种：(1)提取法：利用天然蛋白质资源如干酪素、猪血粉等为原料，经过水解、浓缩、结晶、脱色等步骤，分离提取L-酪氨酸，缺点是分离出高纯度的L-酪氨酸十分困难，且天然蛋白资源中的L-酪氨酸的含量较低，所以提取法的收率较低，不适合大规模生产；从植物如藜豆、猫豆中提取L-多巴的方法受到原料来源的限制，且步骤繁杂、产量低，不能满足市场需求；(2)化学合成法：通过L-苯丙氨酸羟基化或将对羟基苯甲醛与海因通过缩合、碱解、转氨等步骤得到L-酪氨酸，缺点是工艺复杂，反应步骤多，且得到的外消旋体需经光学拆分才能获得有生理活性的L-酪氨酸；传统不对称法合成L-多巴需经8步反应，由于反应条件苛刻、成本高、转化率和立体选择性低，在工业生产上受到限制，且达不到药剂使用要求；(3)酶催化法：主要是利用酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase，简称TPL，Enzyme Commission分类号为EC 4.1.99.2)催化丙酮酸、氨和苯酚或邻苯二酚生成L-酪氨酸或L-多巴。该反应为可逆反应，需要磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶。

此外，如果以邻氟苯酚,愈创木酚或羟基吡啶替代苯酚，TPL还能分别催化生成3-氟-L-酪氨酸，3-甲氧基-L-酪氨酸和氮杂酪氨酸。酶法转化具有专一性强、反应条件温和、选择性强和环境友好等优点，在工业生产L-酪氨酸及其衍生物上有重要的应用价值和开发前景。但野生型TPL往往存在稳定性不够等问题，特别是较高的底物浓度易使野生型TPL失活，所以在实际应用中只能维持较低的底物浓度，且需要以表达TPL的微生物的全细胞的方式参与反应，这样细胞内的TPL与细胞外的底物有所隔离，避免了快速失活。这种反应工艺有不少弊端(Appl Microbiol Biotechnol(2007)77:751–762)，首先是时空产率不高(即单位时间内所能累计的产物浓度偏低，导致生产效率低下且生产成本高企)，全细胞也会将反应原料之一的丙氨酸代谢为其他副产物导致原料的浪费，同时反应结束后产物(产物的形态为固体)与全细胞的分离也增加了额外的成本。因此开发出稳定性更好和/或高活力的工程化TPL多肽以实现不使用全细胞的、高时空产率的、简便的反应工艺，对实现L-酪氨酸及其衍生物的工业化生产有重要意义。

发明内容

1概述

本发明提供了一种对酚类底物稳定性好、催化效能高的工程化多肽，能够用于制备L-酪氨酸及其衍生物，包括左旋多巴。还提供了工程化多肽的基因，含有该基因的重组表达载体，工程菌株及其高效制备方法，以及使用工程化多肽制备L-酪氨酸及其衍生物的反应工艺。使用本发明提供的工程化多肽及其配套的反应工艺，在24小时内所能合成的L-酪氨酸的最终浓度高达200g/L，大大提高了时空产率；且本发明提供的工程化多肽以澄清酶液的形式参与反应，产物以固体的形态很容易被提纯出来，简化了提纯工艺并降低了成本。