[发明专利]人心肌细胞分离试剂、培养基、分离方法和培养方法

说明书

本发明涉及用于人心肌细胞分离的试剂、培养基及分离和培养方法。本发明的人心肌细胞分离试剂含有(‑)‑Blebbistatin，人心肌细胞培养基含有(‑)‑Blebbistatin或para‑aminoblebbistatin。通过采用本发明试剂、培养基及分离和培养方法，能够在分离和培养中将细胞维持在最佳状态、保持细胞形态、存活率和纯度。

技术领域

本发明涉及用于分离人心肌细胞的分离试剂和分离方法。本发明还涉及用于培养人心肌细胞的培养基和培养方法。

背景技术

心血管疾病导致的死亡占因病死亡总数的40％以上，高于肿瘤及其他疾病，是人类生命健康的最大杀手。因此，心血管疾病的防治对人类健康而言至关重要，针对心血管疾病防治的科学研究的重要性自然不言而喻。

研究任何一种疾病的预防和治疗，都要有好的细胞模型。然而，不同于其他体细胞，心血管疾病的研究模型即心肌细胞本身具有运动性强、耗氧高的特点，这一特点决定了其分离与培养过程均需要消耗大量能量并且产生大量代谢产物，导致分离培养条件极难控制，也极难保证分离培养过程中的细胞存活率和纯度。这在很大程度上对心血管疾病的研究带来了局限性。

此外，由于人的心肌细胞模型只能从人体受试者获取，其来源非常稀少且珍贵，现有的分离培养方法又不能保证存活率。因此人心肌细胞的供应远远不能满足临床研究的需要。目前研究中主要使用来自啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)模型的心肌细胞。然而，人类和其他物种的心肌细胞间存在巨大的物种差异，该差异体现在转录组、蛋白组、表观遗传修饰、电生理等各个层面(非专利文献1～4)，导致不同物种的心肌细胞培养方法和条件也存在巨大差异。尽管在其他细胞的培养中可以采用人类组织样本来消除物种差异，但由于现有细胞培养方法无法保证细胞纯度，导致实验结果中出现背景噪音大、或因无生物活性而无法用于功能学实验等不足，无法通过使用组织样本的方式将动物心肌细胞的实验结果类推到人类。现有技术中另外一种获得人心肌细胞的方法是人胚胎干细胞或诱导多能干细胞的定向分化，这一方法虽然部分地克服了上述障碍，但仍存在分化不完全、缺少表观遗传修饰等问题(非专利文献5、6)，从而无法如实反映疾病真实状态，无法推动心血管疾病的研究工作。

综上，现有技术虽然为人心肌细胞的获得提供了多种途径，但目前还没有任何一条途径能够以高存活率、高纯度获得人心肌细胞或其有效模拟物，这严重地阻碍了相关科研工作的开展，无法为临床上的疾病诊断和治疗提供研究基础。

如前文所述，在现有技术中，尽管很早就有研究人员开始探索心肌细胞的分离并培养，但迄今为止还没有任何培养或分离人心肌细胞、特别是人原代心肌细胞(HumanPrimary Cardiomyocyte，hPCM)的报道。在动物心肌细胞的培养中，目前主要使用2，3-丁二酮单肟(2，3-butanedione monoxime，以下简称“BDM”)(非专利文献7、8)。

BDM为骨骼肌肌球蛋白II ATP酶抑制剂，可以抑制骨骼肌和心肌细胞收缩。BDM作为化学磷酸酶，据推测是通过影响钙离子通道、瞬时外向钾通道、钠钙交换以及阻塞细胞间间隙连接通信等途径来影响细胞的收缩。有研究表明，成年小鼠、大鼠心肌细胞分离和培养时加入BDM能够明显提高活细胞数量，并延长体外培养时间。也有报道称BDM通过稳定细胞膜结构、维持细胞骨架稳定来增加糖酵解ATP产物以及负向调节心肌收缩力，由此可以保护心肌细胞。

(-)-Blebbistatin(简称BLEB)是一种已知的与BDM类似的肌球蛋白II ATP酶抑制剂，已知其可以用于抑制小鼠心肌细胞收缩。