[发明专利]一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法

说明书

本发明提供一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，属于基因标记技术领域，包括，收集1‑细胞期的曼氏无针乌贼受精卵；双酶切插入PGEM‑T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接；将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA；将所得Vasa 3’UTR mRNA注射于受精卵进行标记。本发明标记方法通过注射GFP融合Vasa基因合成的Vasa 3’UTR mRNA到早期受精卵，使GFP在PGCs中特异表达从而使得PGCs得到标记，能够对分离冷冻前的曼氏无针乌贼原始生殖细胞进行活体标记，准确度高，技术简便，周期短用途广。

技术领域

本发明属于基因标记技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法。

背景技术

头足类属于软体动物，是海洋生态系统中的重要组成部分，同时对海洋生态平衡有着不可或缺的作用。乌贼属于软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)，广泛分布在各个海域，在生物系统演化中占有重要的地位。其肉质鲜美可口，具有很好的营养价值，蛋白含量极高。除了可以食用以外，还有很高的药用价值，墨囊可以促进血液凝固并且具有抑菌功能，海螵蛸可以药用，耳石可用来分析物种的年龄和海洋环境的时空变化。另外，乌贼还是海洋生态系统中十分重要的生物因子，在生态系统的食物链中扮演着十分重要的角色，对维持海洋生态系的生态平衡起着非常重要的作用。近年来，乌贼作为重要的经济头足类在海洋生态系统中起着关键的作用。由于过度捕捞与环境变化，其资源量一度遭到极大破坏，其自然资源明显衰退，产量急剧下降，渔汛消失，临近濒危。自上个世纪80年代以来，得益于人工繁育和养成技术的突破，其资源量正处于逐步恢复中。

生殖细胞在胚胎发育早期便与体细胞分离，通过分化成两性配子将遗传信息传递给下一代，使物种代代繁衍、生生不息。原始生殖细胞PGCs是最早出现的生殖细胞，它在胚胎发育的早期形成。在原始性腺分化过程中PGCs分别分化为精原细胞和卵原细胞最终产生精子和卵子。因PGCs具有分化为两性配子的潜能，通过异体移植后能够产生供体的后代，因此，PGCs不仅是研究细胞分化及迁移的理想材料，而且通过对PGCs发生发育的研究，对于生殖发育基础理论、种质资源保存都具有深远的意义，由此PGCs已成为海洋生物繁殖领域生殖细胞操作的研究热点。然而目前海水鱼PGCs在胚胎发育过程中的位置和数量仍不清楚，极大的限制了PGCs冷冻保存技术的发展。胚胎整体原位杂交可以跟踪胚胎发育过程中PGCs的迁移就数量变动，但这一技术主要在淡水鱼中易去卵膜的鱼中应用，传统的胚胎整体原位杂交前取样及保存方式并不适用于海水鱼胚胎样品，同时步骤繁琐。因此，建立曼氏无针乌贼胚胎发育过程中PGCs的定位标记方法，揭示曼氏无针乌贼PGCs起源和迁移模式，为曼氏无针乌贼种质资源的保存、生殖调控机制及人工繁殖育种提供了必要的基础知识。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够对分离冷冻前的曼氏无针乌贼原始生殖细胞进行活体标记，准确度高，技术简便，周期短用途广的曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用Vasa基因为标记基因，包括，

收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵；

双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接；

将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA；

将所得Vasa 3’UTR mRNA注射于受精卵进行标记。