[发明专利]一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清白蛋白用于临床用药和生化研究中。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)具有重要的应用价值，不仅在临床上用于治疗出血性休克、烧伤、肝硬化或者肾病引起的腹水等疾病；还应用于药剂辅料、诊断试剂、手性物质分离剂、培养基添加剂等的研究。目前，仅从人血液中提取HSA难以满足市场的需求，且人血来源极其复杂，存在血源污染等潜在威胁。因此，迫切需要一种安全可靠、成本相对低廉的HSA替代品。随着基因重组技术飞速发展，通过基因工程获得重组人血清白蛋白(rHSA)并进一步通过纯化获取rHSA可能是一条有效的解决途径。常用白蛋白提取方法可以分为较传统的蛋白沉淀法和新技术发展而来层析色谱法。沉淀法是通过沉淀的方式来实现目标蛋白与杂质的分离。一般为了使蛋白质发生沉淀，可以通过降低静电力或蛋白质水溶液的稳定性来达到，其中降低蛋白质水溶液的稳定性是通过破坏蛋白质分子周围的水化层来实现。常用的白蛋白的沉淀方法有：低温乙醇沉淀法、盐析法、利凡诺沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、热乙醇沉淀法等。液相色谱法是通过待分离物与固定相之间的物理化学性质以及生物学性质的相互作用的不同来进行分离纯化目标产物。随着材料新技术的发展，液相色谱技术的分离性能更高，适用范围更广，已成为蛋白分离纯化的常用方法。目前液相色谱法主要有凝胶色谱、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱和反相色谱等。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的方法。

本发明提供的对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括：

1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液；

2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液；

3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。

上述方法中，所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得；

具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L；

所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。

所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液；

具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃；

所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃；

所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。