[发明专利]烟粉虱致死基因及其应用、RNA干扰剂及RNA干扰剂的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种烟粉虱致死基因及其应用、RNA干扰剂及RNA干扰剂的制备方法和应用。烟粉虱致死基因为Alpha‑glucosidase。RNA干扰剂为包含根据Alpha‑glucosidase基因片段合成的dsRNA。其制备方法包括引物设计、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离、dsRNA合成等步骤。本发明的烟粉虱致死基因与α‑葡萄糖苷酶的活性相关，根据烟粉虱致死基因设计的RNA干扰剂可抑制α‑葡萄糖苷酶的活性，从而降低烟粉虱水解葡萄糖的能力，最终导致烟粉虱死亡，且同时能对其传播的病毒病进行有效控制。应用于农业中对烟粉虱的去除，及降低病毒病的发生，具有特异性，对哺乳动物以及天敌昆虫无害，见效快、致死率高、对环境无污染等优势。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种烟粉虱致死基因及其应用、dsRNA及dsRNA的合成方法和应用。

背景技术

目前烟粉虱及其传播的病毒病的防控主要依靠大面积使用农药来控制，而传统农药的大面积使用使我国农业生产面临严重的安全问题，因此，开发和使用新技术来摆脱人们对传统化学农药的依赖性刻不容缓，开发基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)的害虫防治新技术正是目前发展趋势下解决该问题的良好途径。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。根据烟粉虱的致死基因及RNA干扰技术的原理，开发RNA干扰制剂，能够高效安全地对烟粉虱进行防治，且同时能对其传播的病毒病进行有效控制。该技术不会改变烟粉虱的基因组，不会影响生态系统，可以针对烟粉虱的特异基因而设计，为化学农药的减施、增效起支撑作用，实现烟粉虱及其传播的病毒病的精准防控。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种烟粉虱致死基因及其应用、RNA干扰剂及RNA干扰剂的制备方法和应用。烟粉虱致死基因与α-葡萄糖苷酶的活性相关，根据烟粉虱致死基因设计的RNA干扰剂可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而降低烟粉虱水解葡萄糖的能力，最终导致烟粉虱死亡，将其制作成RNA干扰剂应用于农业中对烟粉虱的去除，特异性高，对哺乳动物以及天敌昆虫无害；具有见效快、致死率高、对环境无污染等优势。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种烟粉虱致死基因，所述烟粉虱致死基因为Alpha-glucosidase，所述Alpha-glucosidase的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的烟粉虱致死基因的克隆方法包括以下步骤：

(1)用TRIzol法提取烟粉虱的总RNA，合成cDNA第一条链；

(2)根据cDNA第一条链，设计引物对，进行PCR扩增得到PCR产物；

(3)将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，得到目标DNA片段；

(4)将所述目标DNA片段连接载体，并转化至大肠杆菌中获得转化子；

(5)将所述转化子涂布于含有X-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基中进行培养，得到克隆质粒。

进一步的，所述引物对包括上游引物和下游引物。上游引物F1的DNA序列如SEQ IDNO.2所示，具体为：TGAGCATAATGTTGCCAGG；

下游引物R1的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：GCACAAGCGTCACCATAAG。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的烟粉虱致死基因在去除烟粉虱中的应用。