[发明专利]含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法

权利要求书

1.含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤S1、合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因；

步骤S2、构建A/B型嵌合HA质粒：以合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因和构建好的B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的pBD-Ya1688-HA转染质粒为模板，设计并合成构建A/B型嵌合HA质粒的扩增引物，最后采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒；

步骤S3、采用A/B型嵌合HA质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株。

2.根据权利要求1所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S1中合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因前需要对H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列进行碱性裂解位点改造，使其由高致病性病毒变为低致病性病毒。

3.根据权利要求2所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述碱性裂解位点改造是去除碱性裂解位点附近的三个碱性氨基酸，并改变其附近三个氨基酸密码子，具体是去除H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列第342位到第344位的三个碱性氨基酸，同时改变第339位、第341位和第345位的氨基酸的密码子。

4.根据权利要求1～3任一项所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S2设计的扩增引物为：对于H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因，其引物名称为INFUSION-HA-F和INFUSION-HA-R；对于pBD-Ya1688-HA转染质粒，其引物名称为pBD-F-INFUSION和pBD-R-INFUSION；

所述INFUSION-HA-F序列为CTGGGACCATGCCGGCCACAGAAGCAGAGCATT；

所述INFUSION-HA-R序列为TGGGCCGCCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCA；

所述pBD-F-INFUSION序列为TAACCCGGCGGCCCAAAA；

所述pBD-R-INFUSION序列为CCGGCATGGTCCCAGCCT。

5.根据权利要求4所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S2采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒，具体实现方法如下：

步骤S21、扩增带有同源序列的目的片段：取合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因片段，用ddH₂O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板，用引物INFUSION-HA-F及INFUSION-HA-R扩增HA基因胞外区目的片段，并用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物；

步骤S22、回收PCR产物：利用Eastep^TM凝胶及PCR回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收和纯化PCR产物；

步骤S23、制备线性化载体：取构建好的pBD-Ya1688-HA转染质粒，用ddH₂O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板，分别以引物pBD-F-INFUSION及pBD-R-INFUSION扩增载体片段，获得线性化载体；

步骤S24、制备重组产物：将纯化的PCR产物与线性化载体混合，与2×预混液共同于50℃水浴中孵育15分钟后，在冰块上冷却混合物5分钟获得重组产物；

步骤S25、重组反应体系转化感受态细胞，筛选出含有目的片段的克隆；

步骤S26、提取重组质粒即A/B型嵌合HA质粒。