[发明专利]奶牛乳腺上皮细胞损伤模型及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了奶牛乳腺上皮细胞损伤模型及其构建方法和应用。本发明发现无乳链球菌不仅可以黏附和侵入奶牛乳腺上皮细胞，还对奶牛乳腺上皮细胞具有明显的毒性作用，引起细胞发生变形和断裂，诱导细胞发生凋亡，最终导致细胞发生坏死；因此，本发明提供了一种奶牛乳腺上皮细胞损伤模型的构建方法，包括：用无乳链球菌体外感染奶牛乳腺上皮细胞后在CO₂细胞培养箱中培养，即得奶牛乳腺上皮细胞损伤模型。本发明所构建的奶牛乳腺上皮细胞损伤模型为研究无乳链球菌所导致的奶牛乳房炎的分子机制奠定了基础。

技术领域

本发明涉细胞损伤模型的构建方法，尤其涉及奶牛乳腺上皮细胞损伤模型的构建方法，属于奶牛乳腺上皮细胞损伤模型的构建领域。

背景技术

奶牛乳房炎一般由多种病原微生物侵入乳腺引起，从奶牛乳房炎病例中可以分离出多种病原微生物。目前，主要的致病菌金黄色葡萄球菌性乳房炎以及大肠杆菌性乳房炎在世界各个国家被发现和报道；而无乳链球菌作为引起奶牛乳房炎主要的病原体之一则很少受到关注，其致病特性以及感染特性目前尚不清楚。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种革兰氏阳性球菌，其作为引起奶牛亚临床乳房炎的主要致病菌之一，影响着乳产量和乳品质等，严重影响了奶牛场的经济收入。奶牛乳腺上皮细胞是乳蛋白合成的重要场所，其数量和活力与产奶量和乳品质密切相关。当奶牛患乳房炎时，病原菌穿越乳头导管进入奶牛乳腺后，首先接触乳腺上皮细胞，引起细胞发生退化、凋亡或坏死，导致乳腺上皮组织受损，进而影响乳腺正常生理功能，降低奶产量和乳品质。但是，无乳链球菌引起对奶牛的致病特性、感染特性以及引起的乳蛋白变化目前尚不清楚；因此，亟待需要建立无乳链球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤模型，为后续的分子机制研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种奶牛乳腺上皮细胞损伤模型的构建方法；

本发明的目的之二是将所构建的奶牛乳腺上皮细胞损伤模型应用于奶牛乳房炎的致病特性以及感染特性的分子机制研究；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种奶牛乳腺上皮细胞损伤模型的构建方法，包括：采用无乳链球菌体外感染奶牛乳腺上皮细胞后在CO₂细胞培养箱中培养，得到牛乳腺上皮细胞损伤模型。

本发明首先通过扫描电镜观察无乳链球菌对奶牛乳腺上皮细胞形态的影响，发现无乳链球菌在短时间内便黏附于细胞表面且随着感染时间的延长，细胞发生皱缩、变形，细胞表面微绒毛脱落，细胞从边缘折叠发展为细胞膜破裂，细胞断裂。同时，这也验证了无乳链球菌感染细胞后，细胞培养液中的LDH浓度上升是由于细胞受到严重损伤，细胞破裂死亡造成的。结果表明无乳链球菌感染细胞短时间内便引起细胞膜的破裂，胞内 LDH的释放，导致整个细胞崩解。细胞的形态结构影响着其功能，当病原菌使细胞的形态结构发生变化，导致细胞受损时就会影响其正常的生理功能，降低其防御能力，病原体进一步侵入乳腺内部造成进一步的感染。

本发明由此发现无乳链球菌不仅可以黏附和侵入奶牛乳腺上皮细胞，还对奶牛乳腺上皮细胞具有明显的毒性作用，引起细胞发生变形和断裂，诱导细胞发生凋亡，最终导致细胞发生坏死，因此，本发明采用无乳链球菌体外感染奶牛乳腺上皮细胞构建得到牛乳腺上皮细胞损伤模型。

其中，所述的感染方法包括：(1)将奶牛乳腺上皮细胞制成细胞悬液后接种于96孔板，待细胞达到90％及以上融合时吸出细胞培养液，清洗；(2)每孔加入无乳链球菌悬液于37℃、5％CO₂细胞培养箱中进行培养。

其中，所述的无乳链球菌优选为牛源无乳链球菌；

优选的，步骤(1)中将奶牛乳腺上皮细胞用完全培养液制成1×10⁵ cells/mL的细胞悬液以200uL/孔接种于96孔板；