[发明专利]一种肠道外泌体提取方法

说明书

本发明提供一种肠道外泌体提取方法，包括如下步骤：⑴管状肠样本处理及清洗；⑵利用二硫苏糖醇溶液反复清洗肠道组织；⑶分离肠上皮细胞；⑷分离肠上皮细胞；⑸将分离液离心取上清进行初步过滤，去除细胞及细胞碎片；⑹获取向体内分泌的外泌体。本发明利用EDTA消化法高效地将肠上皮层及粘膜下层分离，再从分离液中用超速离心法获取肠道向体内分泌的外泌体。相对于常规组织酶消化获取外泌体的方法，此方法成本更低、获得的外泌体纯度更高。

技术领域

本发明涉及一种提取方法，尤其是一种高效率、低成本的实验动物肠道外泌体提取方法，属于实验动物的检测检验技术领域。

背景技术

肠上皮细胞作为机体接触外界的第一门户，需要能够不断接受来自食物、肠道微生物等外界物的刺激，进而调节机体内部做出合理的应答。目前已有大量的证据表明，肠道可以调控机体各个部位的器官和组织。研究结果显示，肠上皮可以通过“肠脑循环”影响神经炎症及线粒体功能，与神经退行性疾病、脑卒中等密切相关；还能够以 “肠肌轴”引起骨骼肌代谢异常、细胞数量及细胞体积下降，进而诱发肌肉功能的下降；更有研究报道，肠道与缺血相关性疾病、心脏淀粉样变性、扩张型心肌病和心内膜心肌纤维化发生率增加密切相关。因而，肠道是远端器官和组织的重要调节者。然而，对于肠道调控远端的方法还是未知。

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外纳米级小囊泡，可以转运核酸（如微小RNA，miRNA）、蛋白质和脂质等生物活性分子，进入受体细胞中发挥调控作用，是目前器官或组织之间远程调控的重要研究靶点。

已有研究者在肠上皮肿瘤细胞株中证实，肠上皮细胞具有强于其他器官的外泌体分泌功能。肠上皮细胞以极化方式分泌外泌体，一方面朝向肠腔，这部分外泌体可能是宿主microRNAs能够突破肠道自身的天然粘液屏障，影响肠道微生物的主要来源；另一方面分泌至粘膜下，进而通过粘膜下回流系统到达远端器官或组织，实现重要的远程调控。

目前对外泌体的提取主要限于自血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液，虽然2017年Pérez-González等创新性地利用木瓜酶对脑细胞进行解离，从脑细胞外间隙中成功提取到了外泌体，但该方法并不适合肠道。因为，肠粘膜为皱褶样结构，极为复杂且与粘膜下层紧密相连、无法进行机械性分离。

发明内容

本发明针对上述提出的技术问题，提出一种肠道外泌体提取方法，根据肠道上皮双向性的组织特点，利用EDTA消化法高效地将肠上皮层及粘膜下层分离，再从分离液中用超速离心法获取肠道向体内分泌的外泌体，分别获取肠道向体外及体内分泌的外泌体。

本发明解决以上技术问题的技术方案是：提供一种肠道外泌体提取方法，包括如下步骤：

⑴管状肠样本处理及清洗；

⑵利用二硫苏糖醇溶液反复清洗肠道组织，可减少浆膜面细胞对提取过程的污染；

⑶收集步骤②的洗涤液，经低温超速离心获取向体外分泌的外泌体；

⑷分离肠上皮细胞：将步骤②中的肠管移至EDTA肠上皮分离液中，并放置于冰上孵育25-40min促使上皮层脱落，再采用震荡至上清浑浊；

⑸将分离液离心取上清进行初步过滤，去除细胞及细胞碎片；

⑹将步骤⑤获取的过滤液，经低温超速离心获取向体内分泌的外泌体。

本发明的进一步限定技术方案，前述的肠道外泌体提取方法，所述EDTA是一种与Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺二价金属离子结合的螯合剂，通过该螯合剂螯合肠上皮细胞的Ca²⁺，使肠上皮细胞的Ca²⁺与粘膜下层温和分离，释放粘膜下层细胞外基质。