[发明专利]刺盘孢属特异性引物筛查检疫鉴定方法

说明书

本发明涉及微生物鉴定及检验技术领域，具体涉及刺盘孢属特异性引物筛查检疫鉴定方法。本发明提供用于鉴定刺盘孢属真菌的靶序列、特异性引物对(序列如SEQ ID NO.1‑2所示)以及探针(序列如SEQ ID NO.3所示)。本发明提供的靶序列、特异性引物和探针具有高度的刺盘孢属真菌的普适性以及属特异性，能够有效区分刺盘孢属真菌与其它微生物，本发明提供的刺盘孢属真菌的鉴定方法具有通用性强、特异、灵敏、准确、快速、操作简单的优势，适于广泛推广应用。

技术领域

本发明涉及微生物鉴定及检验技术领域，具体涉及鉴定刺盘孢属真菌的靶序列、特异性引物对、探针以及鉴定刺盘孢属真菌的方法。

背景技术

刺盘孢属(Colletotrichum，又名炭疽菌属)，由Corda在1831年建立，隶属于小丛壳目(Glomerellales)、小丛壳科(Glomerellaceae)。该属中大多数都是植物病原真菌，可以侵害多种农作物、经济作物和观赏植物等，形成以炭疽病为主的多种病害，被认为是世界十大重要植物病原真菌之一(Dean et al.2012)。其中造成重大经济损失的病原菌包含咖啡浆果刺盘孢Colletotrichum kahawae subsp.kahawae、暹罗刺盘孢C.siamense、胶孢刺盘孢C.gloeosprioides、果生刺盘孢C.fructicola、平头刺盘孢C.truncatum、尖孢刺盘孢C.acutatum、博宁刺盘孢C.boninense、菜豆刺盘孢C.lindemuthianium、镰形刺盘孢C.falcatum等。其中，咖啡浆果刺盘孢C.kahawae subsp.kahawae已被列入中国和亚洲其他国家以及拉丁美洲的一些国家检疫名录中，该种是造成整个非洲广泛种植的阿拉伯咖啡浆果病害的罪魁祸首，能够造成毁灭性的咖啡浆果炭疽病害，损失高达30％-70％，甚至绝产，是重要植物检疫对象。

刺盘孢属病菌是检疫口岸检出频次最高的有害植物病原真菌之一。区分和鉴定刺盘孢属真菌对口岸检疫人员来说不仅任务繁重，而且是一个很大的挑战。有害生物入侵的超前预警、快速检测、风险分析和科学控制是防范外来物种的核心内容，其中，有害生物鉴定是其中的首要环节。对咖啡浆果刺盘孢及其近缘种进行有效识别，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的作用。目前，进出境口岸对检疫性刺盘孢种类鉴定的主要流程是菌株分离、形态观察、序列测定和分析，但是这样的操作远远不能满足口岸部门对于有害病原菌高效、精准的检出要求。

尽管现有技术中已有一些利用分子生物学手段进行刺盘孢属某些物种的特异性检测和鉴定，如：巢式PCR快速检测胶胞炭疽菌的体系建立及应用(CN201810429586.1)、一种定量检测芒果炭疽菌的方法(CN201810062983.X)、一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用(CN201510030095.6)、一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用(CN201510031690.1)。但是，这些方法每次只能检测一种刺盘孢属物种，普适性较差，在检疫性鉴定应用方面存在缺陷，不能满足口岸日常检测筛查的需要。因此，建立刺盘孢属的属水平病原菌的特异、灵敏、快速和有效的分子检测方法在实践和应用研究中是十分必要的。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种普遍适用于各种刺盘孢属真菌的特异、灵敏、快速的刺盘孢属真菌的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过对刺盘孢属真菌物种、同科近缘属以及其它常见真菌(尤其是常见植物病原真菌)的基因组序列进行大量的分析和比对，确定了在刺盘孢属真菌中高度保守且具有属特异性的、能够很好地适用于各种刺盘孢属真菌的特异性靶序列以及特异性引物对和探针，该特异性引物对可以单独用于刺盘孢属真菌的PCR鉴定，也可结合特异性探针使用利用荧光定量PCR进行刺盘孢属真菌的鉴定。上述特异性引物或特异性引物探针组合能够实现刺盘孢属真菌的特异、灵敏、准确、快速鉴定。