[发明专利]一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过筛选获得了如SEQ ID NO.1所示的能够提高热凝胶水解效率的基因，并将其在毕赤酵母中表达，使β‑1,3‑内切葡聚糖酶的酶活由277.8U/mL提高至333.3U/mL，热凝胶的水解效率提高了20％。

技术领域

本发明涉及一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

热凝胶是一种由β-1,3-糖苷键连接而成的无分支线性葡聚糖，热凝胶低聚糖(热凝胶水解产物β-1,3-葡寡糖)具有益生元活性，目前热凝胶的水解方法主要为酸解法，但水解效率和寡糖得率均较低，且发酵过程难以控制、污染严重。内切β-1,3-葡聚糖酶在裂褶菌、黄蓝状菌、哈茨木霉、毕赤酵母等菌株中均有表达，具体包括，利用哈茨木霉、重组毕赤酵母KM71(启动子为AOX且导入了内切β-1,3-葡聚糖酶)以及重组毕赤酵母GS115(启动子替换成GAP且导入了内切β-1,3-葡聚糖酶)生产内切β-1,3-葡聚糖酶。目前市售β葡聚糖酶中内切β葡聚糖酶含量低，纯度较高的内切β葡聚糖酶制剂价格比较昂贵，增大了寡糖制备成本，内切β-1,3-葡聚糖酶可高效水解热凝胶制备β-1,3-葡寡糖。

毕赤酵母具有细胞生长快、易于培养，蛋白表达完整、重组质粒整合在染色体上，遗传性能稳定、外源基因不易丢失，外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的分离纯化等特点。启动子为AOX的重组毕赤酵母KM71产酶时需要额外加入甲醇诱导，这增加了发酵产酶的不稳定性，且甲醇有毒，对人体有害，而启动子替换成GAP的重组毕赤酵母GS115却不存在以上的问题，但是水解热凝聚的效率有待于进一步提高。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种编码β-1,3-葡聚糖酶的基因，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供所述基因编码的β-1,3-葡聚糖酶。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或含有所述基因的细胞系。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，表达SEQ ID NO,1所示的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母是毕赤酵母GS115。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌在水解热凝胶方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是所述基因工程菌的发酵液加入至含10～20g/L的底物的体系中，在pH5～7，温度30℃～60℃下反应1～3h。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以0.1～0.3U/g底物的添加量向反应体系中加入发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以0.15U/g底物的添加量向反应体系中加入发酵液。

本发明还要求保护所述基因或所述基因工程菌在制备含β-1,3-葡寡糖的产品方面的应用。

有益效果：本发明通过在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示的基因，使β-1,3-内切葡聚糖酶的酶活由277.8U/mL提高至333.3U/mL，热凝胶的水解效率提高了20％。

具体实施方式

水解效率(总酶活力)的计算方法：每分钟水解热凝胶生成1微克葡寡糖所需的酶量为1酶活单位(U)。

实施例1基因工程菌的构建

步骤1：将携带β-1,3-内切葡聚糖酶基因的JM109大肠杆菌菌株(公开于论文《土壤杆菌-毕赤酵母耦合培养直接生产热凝胶低聚糖》中)划线接种在LB培养基上37℃过夜培养14h-16h；