[发明专利]一种猪腹膜间皮细胞的培养方法

权利要求书

1.一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液；

将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞；

待所述原代细胞密度达到80％～90％时，使用传代培养液对所述原代细胞进行传代，得传代细胞；

其中，所述原代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、15％～20％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS；

所述传代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、10％～15％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。

2.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液的步骤之前，还包括：

取猪的腹膜，清除掉所述腹膜表面残余的脂肪，于无菌环境下，用PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。

3.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液的步骤包括：

将清理后的腹膜平铺于培养皿中，加入胰酶-EDTA细胞消化液使所述腹膜被完全浸没，于恒温培养震荡器中消化20～30min，得消化液；

向所述消化液中加入胎牛血清终止消化，弃去所述腹膜，得原代细胞悬液；

其中，所述胎牛血清的加入量为所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量的15％～20％(v/v)。

4.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞的步骤包括：

将所述原代细胞悬液以1500～2000rpm转速离心10～15min，弃去上清液，保留沉淀；

将所述沉淀用原代培养液重悬，移入细胞培养瓶中，于CO2培养箱中培养，得原代细胞。

5.如权利要求4所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将所述沉淀用原代培养液重悬，移入细胞培养瓶中，于CO₂培养箱中培养，得原代细胞的步骤中，所述于CO₂培养箱中培养时，开始培养后的第30～36h首次更换所述原代培养液，之后，每隔22～24h更换一次所述原代培养液。

6.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，待所述原代细胞密度达到80％～90％时，使用传代培养液对所述原代细胞进行传代，得传代细胞的步骤包括：

待所述原代细胞密度达到80％～90％时，用PBS润洗所述原代细胞，然后加入胰酶-EDTA细胞消化液，于CO₂培养箱中消化2～6min后，加入传代培养液终止消化，得混合悬液；

吹打所述混合悬液至细胞悬浮后，以800～1500rpm转速离心6～10min，弃去上清液，加入所述传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，得传代细胞。

7.如权利要求6所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，待所述原代细胞密度达到80％～90％时，用PBS润洗所述原代细胞，然后加入胰酶-EDTA细胞消化液，于CO₂培养箱中消化2～6min后，加入传代培养液终止消化，得混合悬液的步骤中，

所述传代培养液的加入量与所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量相等。