[发明专利]一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种米曲霉脂肪酶突变体及在拆分(R,S)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯制备(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行定点饱和单突变或多突变获得的。本发明通过比较突变体酶AOL‑3^F38N、AOL‑3^F38N‑V230R和未突变酶AOL‑3的水解能力，结果发现突变体酶AOL‑3^F38N、AOL‑3^F38N‑V230R的水解活性是未突变脂肪酶的3.4倍和4.0倍，改造后的脂肪酶的热稳定性在50℃以后表现的更好，(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯产率提高，更加适合工业化生产。

(一)技术领域

本发明涉及一种随机突变结合定点饱和突变获得的米曲霉脂肪酶突变体及其拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的应用，属于酶工程、基因工程技术领域。

(二)背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3，triacylglycerol lipase)即甘油三酯水解酶，可以作用在油水界面，能进行酯合化、酯水解、醇解、转酯等多种反应。脂肪酶广泛存在于自然界中，来源繁多，在植物、动物、微生物中均有发现。其中，产脂肪酶微生物的获得相对简单，适合进行大规模生产，有发酵周期短等优点，是工业用脂肪酶的重要来源和研究热点。产脂肪酶的微生物主要集中在根霉、曲霉、毛霉、青霉菌属等有工业应用前景的菌株。但是在传统的微生物研究中，自然界被开发利用的资源仅在1％左右，很多新型的脂肪酶还未被挖掘利用。随着研究的深入，发现很多脂肪酶具有结构选择的专一性，可以被用于手性化合物的合成和拆分，在油脂、农业、日用品、食品工业和药物合成等领域都能被应用。

米曲霉主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处，还可用于生产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益生素等，被美国食品和药物管理局(Food and DrugAdministration，FDA)及世界卫生组织(World Health Organization，WHO)列为食品级安全菌株。米曲霉脂肪酶来源于米曲霉，最早在食品发酵过程中被发现，随后许多研究发现米曲霉脂肪酶在手性拆分、酯交换、酯合成方面有很大的作用。野生的米曲霉脂肪酶的产量低，催化活性、稳定性等不够理想，所以需要后期利用分子改造技术来提高。像丹麦NovoNordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商也利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。

(R)-2-(4-羟基苯氧基)乙酯((R)-EHPP)是合成芳氧苯氧丙酸酯类除草剂(Aryloxy phenoxy propionate，简称APP)的关键手性中间体，APP类除草剂是一类能够有效防除禾本科杂草的除草剂，也是一类发展较迅速、不断开发出新品种的除草剂，迄今为止已有20个品种商品化，其中噁唑禾草灵、炔草酯、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵是近几年来同类除草剂市场全球销售额最高的几个农药产品，由于手性APP类除草剂具有安全，高效和低毒等特性，近几年来该类除草剂越来越受到大家的关注。

(三)发明内容

本发明提供了一种米曲霉脂肪酶突变体，在最适的反应条件下，水解活性有明显的提高，在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的应用中有更高的效率。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种米曲霉脂肪酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行单点或多点饱和定点突变获得的(优选通过易错PCR结合定点饱和突变的方法来获得突变子)。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列(米曲霉脂肪酶)的编码基因序列为SEQ ID NO.2所示。