[发明专利]用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物、试剂盒及其应用

权利要求书

1.用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物组，其特征在于，包含如下引物：

Foxp3–F：5′-GGCATCATCTGACAAGGGTT-3′；

Foxp3-R：5′-TTGTGAAAGAAATCTGGGAA-3′；

IL-10-F：5′-GCGACTTGTTGCTGACCG-3′；

IL-10-R：5′-CCATCACTCTCTGCCTTC-3′。

2.用于猪Foxp3、IL-10基因TaqMan实时荧光定量双重PCR检测的试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组，以及如下荧光探针：

Foxp3-荧光探针：核苷酸序列为5′-GTATTGTAGCCACTGGCACC-3′，其5′末端连接第一荧光基团，3′连接第一淬灭基团；

IL-10-荧光探针：核苷酸序列为5′-CTGCTGGAGGACTTTAAGG-3′，其5′末端连接第二荧光基团，3′连接第二淬灭基团；

所述第一荧光基团与所述第二荧光基团发射的荧光信号不同。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM；所述第二荧光基团为CY3；所述第一淬灭基团和所述第二淬灭基团均为TAMRA。

4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂；其中，引物Foxp3-F、Foxp3-R、IL-10-F、IL-10-R、Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针独立包装或混装在一起。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物Foxp3-F、Foxp3-R、IL-10-F、IL-10-R、Foxp3-荧光探针和IL-10-荧光探针混装在一起，其摩尔比为1:1:1:1:6:6。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准阳性对照、标准阴性对照和PCR扩增反应液；所述标准阳性对照为含Fxop3和IL-10基因的重组质粒18-T-Fxop3-IL-10，其中Foxp3和IL-10串联重组，定向插入18-T的多克隆位点；所述标准阴性对照为RNase Free dH₂O；所述PCR扩增反应液包括：2×One Step RT-PCR BufferⅢ、Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ、RNase Free dH₂O和RNase Inhibitor。

7.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4-6任一所述的试剂盒在猪Foxp3、IL-10基因双重PCR检测中的应用。

8.一种TaqMan实时荧光定量PCR检测猪Foxp3、IL-10基因转录水平的方法，其特征在于，采用权利要求2或3所述的试剂或权利要求4-6任一所述的试剂盒进行检测，包括如下步骤：

(1)以含Fxop3和IL-10基因的重组质粒为模板，利用所述试剂或试剂盒中的引物和荧光探针进行实时荧光定量双重PCR反应，以基因拷贝数的log[10]对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程式；

(2)提取待测样品的总RNA，利用所述试剂或试剂盒中的引物和荧光探针进行实时荧光定量双重RT-PCR反应，获得Foxp3和IL-10基因的Ct值；

(3)将Foxp3和IL-10基因的Ct值分别代入各自的标准曲线方程式，计算得到猪Foxp3和IL-10基因的拷贝数，其代表了待测样品中猪Foxp3和IL-10基因的转录水平。