[发明专利]一种水稻耐盐基因OsRR22引导引物、应用和靶点载体及靶点载体制备方法

权利要求书

1.一种水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物，其特征在于，所述的水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物的核苷酸序列为：

RR22-gRT+：5’-AGAGGGATCAATTCCCCGTgttttagagctagaaat-3’

RR22-OsU6aT-：5’-ACGGGGAATTGATCCCTCTCggcagccaagccagca-3’。

2.权利要求1所述的水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物在编辑水稻基因组中的应用。

3.根据权利要求2所述的水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物在编辑水稻基因组中的应用，其特征在于：

所述的应用包括利用PCR扩增的方法构建权利要求1所述的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；

将sgRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体；

将靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，得到水稻耐盐基因OsRR22突变体。

4.一种靶点CRISPR/Cas9-sgRNA，其特征在于：含有权利要求1所述的水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列片段。

5.根据权利要求4所述的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体的制备方法，包含以下特征步骤：

以pYLgRNA-OsU6a/LacZ质粒为模板，

在两个反应体系中分别进行第一轮PCR扩增：U-F和RR22-U6aT-扩增OsU6a-靶点片段，gR-R和RR22-gRT+扩增gRNA-靶点片段；第二轮PCR用U-GAL和Pgs-GAR引物扩增产生含靶点序列sgRNA表达盒，采取Gibson assembly方法组装sgRNA表达盒和CRISPR/Cas9载体。

6.根据权利要求5所述的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体的制备方法，其特征在于：所述的Gibson assembly的引物为

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’

gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’

U-GAL：5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’

Pgs-GAR：5’-TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’。

7.根据权利要求5所述的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体的制备方法，其特征在于：所述的CRISPR/Cas9载体为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H。