[发明专利]紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法

权利要求书

1.紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)菌种培养

菌株培养：将M1菌株在马铃薯固体培养基上活化2代，取适量菌液接种到种子培养基中，30℃、200r/min培养2d，按10％的接种量将种子液接种到发酵养基中，30℃、150r/min培养2d，再25℃、150r/min培养13d；

(二)mokH缺失菌株构建

从紫色红曲菌M1基因组中克隆mokH基因，将mokH基因酶切回收后连接到pUC18质粒上，再以pCAMBIA302质粒为模版克隆CaMV35S启动子及潮霉素B抗性基因，将带有启动子的潮霉素B抗性基因插入到pUC18-mokH重组质粒的mokH中，从而构建置换型打靶载体pUC18-mokH-hph，并采用REMI转化法将打靶载体转化到紫色红曲菌M1原生质体中，使其与紫色红曲菌M1基因组DNA发生置换型同源重组，将潮霉素B基因整合到基因组上，使mokH基因失活，从而构建mokH基因缺失株。

克隆mokH基因的具体步骤是：根据紫色红曲菌M1基因组DNA浓度将其稀释10倍后作为模版来扩增mokH基因；mokH基因的扩增所需PCR反应体系和条件如下：

mokH基因的PCR反应体系

PCR反应体系	体积
PrimeSTAR Max Premix(2X)	12.5μL
mokH-F	1μL
mokH-R	1μL
M1基因组DNA	1μL
2O]]>	9.5μL
总体系	25μL

PCR反应条件：

克隆CaMV35S启动子及潮霉素B抗性基因，hph基因的扩增所需PCR反应体系和条件如下：

hph基因PCR反应体系

PCR反应体系	体积
2×Taq PCR mix	25μL
hph-H-F	1μL
hph-H-R	1μL
pCAMBIAl3O2质粒	2μL
2O]]>	21μL
总体系	50μL

PCR反应条件：

所使用的引物序列如下：

Primer	Sequence(5’-3’)
mokH-F	GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT(XbaI)
mokH-R	CCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT(HindIII)
hph-H-F	ACGCGTCGACGTTTGCGTATTGGCTAGAGC(SalI)
hph-H-R	ACGCGTCGACTAATTCGGGGGATCTGGATTT(SalI)
hph-F(未带启动子)	ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC
hph-R(未带启动子)	CTATTTCTTTGCCCTCGGACG

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