[发明专利]一种小鼠Prg4原位杂交探针的制备方法

说明书

本发明涉及一种小鼠Prg4原位杂交探针的制备方法。本发明的探针为小鼠Prg4variant序列探针，信号强、特异性强，可作为小鼠关节软骨表层和半月板表层的检测。本发明方法制得的探针可高选择性地标记小鼠关节软骨表层和半月板表层，为进一步研究Prg4基因的性质和关节软骨表层和半月板表层细胞亚群定位打下基础。

技术领域

本发明属于分子检测领域，涉及一种小鼠Prg4原位杂交探针的制备方法。

背景技术

蛋白多糖4(PRG4)主要由滑膜细胞和浅表区软骨细胞分泌的大蛋白多糖，含有硫酸软骨素和硫酸角质素糖胺聚糖，存在于关节软骨和关节软骨表面，在关节润滑和滑膜稳态中起重要作用。PRG4可通过抑制分解代谢因子，软骨细胞凋亡和滑膜细胞过度生长的表达来提供关节软骨边界润滑并延缓关节炎的进展。

随着单细胞测序技术的展开，通过特异性基因对细胞亚群进行定位成为一种鉴别细胞亚群的方法。

目前虽然有Prg4抗体进行免疫组化染色来进行定位，但是该抗体工作效率较差，很少有利用该抗体的相关的结果报道；免疫组化染色仍旧是蛋白水平的检测，而原位杂交精准地反应了基因表达水平。Prg4特异性表达在关节软骨表层和半月板表层，是鉴别表层关节软骨的黄金指标，目前没有公开的Prg4探针序列及其引物的信息。

鉴于此，发展能够检测小鼠关节软骨表层和半月板表层的细胞亚群的分析方法是极其重要和有意义的。

发明内容

针对现有技术的上述不足，根据本发明的实施例，希望提供一种制备简单的高灵敏度、高选择性的细胞亚群的探针，从而能够有效检测小鼠关节软骨表层和半月板表层的细胞亚群。为此，本发明制备了一类新颖的检测探针，其制备简单、选择性好、灵敏度高。

根据实施例，本发明提供了一种小鼠Prg4原位杂交探针的制备方法，包括如下步骤：

①设计引物序列，包括正义链、反义链和探针长度；

②在上述正义链和反义链两端分别加上限制性内切酶EcoRI和NotI序列；

③扩增Prg4 DNA序列，并纯化，以1:5核苷酸浓度，连接质粒和Prg4；

④克隆：将连接有Prg4的质粒与大肠杆菌混合培养；

⑤序列检测，与Prg4序列比对，选择一致序列的DNA；

⑥以反转录酶T7和SP6为引物，PCR法线性化Prg4 DNA；

⑦通过SP6逆转录酶逆转录Prg4 DNA为Prg4反义RNA，同时标记地高辛；

⑧纯化Prg4探针。

优选地，本发明前述制备方法中，步骤①所用引物序列如下：

正义链：ATGGGGTGGAAAATACTTCCC，反义链：TCAAGGACAGTTGTACCAGATTTTGG，探针长度：1276bp。

优选地，本发明前述制备方法中，步骤②所用限制性内切酶EcoRI和NotI序列如下：

EcoRI-Prg4 F：CGG AAT TCA TGG GGT GGA AAA TAC TTC CC

Not I-Prg4 R：ATT TGC GGC CGC TCA AGG ACA GTT GTA CCA GAT TTT GG。

此外，本发明还提供了用于检测小鼠关节软骨表层和半月板表层的检测制剂或试剂盒，其包含本发明的探针。