[发明专利]一种不对称二甲基精氨酸卵黄抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种高效便捷且低成本制备不对称二甲基精氨酸（NG，NG，dimethyl‑L‑arginine，asymmetric dimethylarginine，ADMA）抗体的方法。包括：兔白蛋白‑ADMA免疫蛋鸡；分离鸡蛋获得卵黄，连续高速低温离心，去除脂颗粒，获得卵黄抗体上清液；将卵黄抗体上清通过层析柱分离获得浓缩卵黄抗体液。本方法具有较强的特异性，成本低，产量大，操作简便快速，绿色环保，可实现大规模产业化生产等优点。

技术领域

本发明属于生物制品制备技术领域，尤其是通过免疫、饲养技术获取抗体并制备成药品或保健品的生物技术，具体地涉及快速提取卵黄抗体的方法、提取的卵黄抗体制备的不对称二甲基精氨酸抗体产品及其应用。

背景技术

ADMA，即非对称二甲基精氨酸简称，是内源性一氧化氮合酶的竞争性抑制剂，减少一氧化氮的生成，并诱发氧自由基生成，促进炎症反应，是影响血管内皮细胞功能障碍的重要因素。血浆中ADMA浓度升高与多种心血管发病风险因子相关，并参与调解这些风险因子对内皮血管的作用。大量证据表明ADMA是心血管疾病发生发展的标志物，并且能独自显著的预示心血管疾病和死亡率的发生。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，简称为IgY。与血清抗体相比，卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)无需采血，只需采集免疫高免鸡蛋卵黄纯化即可纯化得到卵黄抗体；(2)有良好的稳定性，耐热耐酸，且常温下仍能保持一定的活性；(3)治疗效果明显，特异性强，且可适应大规模生产；(4)安全、高效、无残留、温和环保。

目前，ADMA抗体的获得多是通过取免疫动物的血液进行分离纯化获得，该方法耗时耗力，不适合用于大规模生产。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种高自动化、高效率、高纯度、高活性的卵黄抗体制备方法，并将提取的特异性IgY作为诊断抗体建立检测ADMA的免疫学方法，用于ADMA的检测。

本发明通过以下技术方案实现：

蛋鸡免疫：将兔白蛋白-ADMA抗原免疫蛋鸡，制备高免蛋；

卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒；打蛋后再离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液；通过层析柱分离收集获得纯化的IgY液。

所述的蛋鸡免疫，为兔白蛋白-ADMA抗原分4次对产蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周。

所述的鸡蛋外壳消毒具体为：用75％乙醇喷洒鸡蛋表面进行消毒。

所述的打蛋后再离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液，具体为：将消毒后的高免鸡蛋进行手工或者机械进行破壳操作，连续高速低温离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液。

所述的通过层析柱分离收集获得纯化的IgY液，具体为：将权利要求4所获得的卵黄抗体IgY上清液，通过柱层析的方法进行纯化。

附图说明

图1是本发明IgY提取工艺流程图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的内容作出的一些非本质的改进和调整也属于本发明保护的范围。

1.用兔白蛋白-ADMA作为抗原，选择18周龄蛋鸡，分别于第0周、第4周、第8周、第12周进行免疫；免疫部位为鸡翅根肌和胸肌皮下各两点进行皮下注射，次免由皮下注射换为肌肉注射；第10周开始收集鸡蛋，用于IgY提取。

2. 蛋的预处理：用75％的消毒乙醇喷洒在鸡蛋表面进行消毒10分钟，然后送入蛋清蛋黄分离机，进行破壳和蛋清蛋黄分离，收集卵黄得到卵黄液。

3. IgY的提取：抗体IgY上清液，通过柱层析的方法进行纯化。