[发明专利]一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用

说明书

本发明提供了一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用，属于基因工程领域。本发明提供的启动子P_gapA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述启动子P_gapA能够启动下游基因在乳酸菌中的高效表达，蛋白表达活性显著高于传统诱导型P_NisinA的表达活性，是一种超高效启动子。本发明的启动子PgapA与目标基因其所组成的蛋白表达框，表达载体以及宿主菌可以用于肽类和蛋白类药物的口服药物递送，不仅在基因工程中具有良好的应用前景，还可以提高患者的服药依从性，有望产生可观的社会和经济效益。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用。

背景技术

随着生物技术的发展，很多活性多肽和蛋白质被开发成药物并应用于临床。用于治疗或诊断的多肽、蛋白质、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等药物不断出现，以红细胞生成素、干扰素和胰岛素为代表的近百种多肽和蛋白质药物已经在临床应用。与传统的化学合成药物相比，多肽和蛋白质药物具有作用靶点专一、体内作用明确、药效作用强、毒副作用少等优点，故在现代疾病的预防和治疗中的应用日益广泛。但针对免疫治疗的抗体等多肽和蛋白质由于分子量大、结构相对复杂和理化性质特殊，机体对其产生了多种屏障，如酸屏障、酶屏障和膜屏障，限制了这类药物的口服吸收。因此目前此类药物仍局限于静脉、皮下和肌肉注射等侵入式给药方式，导致生产、运输、储存成本高，并有传染疾病的风险，是其一大缺憾。

近年来，随着细菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富，以活体益生菌为递送载体的药物递送逐渐成为应用研究的一个热点。与传统抗体药物递送系统相比，益生菌口服药物递送系统具有以下优点：①益生菌在食品领域已被广泛应用，获取成本低，安全性高且无毒副作用；②重组益生菌制备而成的液态或固态菌剂可直接口服，无需注射，避免了注射部位的不良反应；③该口服递送系统不会产生耐药性，因此益生菌是一个十分良好的多肽和蛋白类药物的递送载体。然而目前现有技术存在蛋白表达效率低的问题，极大限制了该系统的应用。

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段关键DNA序列，对基因的表达具有重要的调控作用。研究表明，在控制基因表达的各种序列中，启动子所占的影响力超过45％，因此，筛选高活性的启动子对于提高基因的表达，实现以益生菌为载体的口服药物递送系统的临床应用至关重要。而目前，益生菌中启动子存在启动性能的问题，影响了益生菌递送载体治疗疾病的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明为了解决目前乳酸菌系统中蛋白表达量低的问题，提供一种超高效组成型乳酸菌启动子。同时基于所述组成型乳酸菌启动子，本发明还提供了包含所述启动子的重组载体及其重组菌和应用，重组载体或重组菌基于高效启动下游基因表达，可以用于蛋白类药物的口服药物递送，能够用于制备治疗多种疾病的药物。

本发明提供了一种组成型乳酸菌启动子，所述启动子的核苷酸序列如序列表SEQID No.1所示或为与序列表SEQ ID No.1所示的互补序列。

本发明提供了一种含有所述启动子的重组载体。

优选的，所述重组载体中基础载体为pNZ8149；

所述重组载体还包括目标基因；

所述目标基因为编码人源PD-1/PD-L1信号通路的抑制剂的序列或编码PD-1/PD-L1信号通路和TGFβ/TGFβR2信号通路抑制剂的序列。

优选的，所述编码人源PD-1/PD-L1信号通路的抑制剂的序列包括人源PD-1胞外域结构蛋白的核苷酸序列或编码包含人源PD-1胞外域结构蛋白的融合蛋白的序列；

所述人源PD-1胞外域结构蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述编码包含人源PD-1胞外域结构蛋白的融合蛋白的序列为编码人源PD-1胞外域-人源TGFβR2胞外域融合蛋白的序列。