[发明专利]一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途

权利要求书

1.一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：将胚胎干细胞在10CM细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养7-10天形成熟拟胚体，然后将成熟拟胚体打散、贴壁培养于一号Neurobasal培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化，形成神经干细胞，然后将诱导而成的神经干细胞置于二号Neurobasal培养基中，选择处于2-3代对数生长期的神经干细胞收集培养基；

步骤B：吸出二号Neurobasal培养基，将神经干细胞置于DMEM/F12培养基中继续培养12小时，然后将细胞和培养基转移至离心管进行离心处理，收集离心管中的上清，备用；

步骤C：将收集的上清分装到离心管，每管15mL，然后将各离心管冷冻干燥，离心管里形成固体粉末；

步骤D：取每管冷冻干燥的粉末，采用1.5mL去离子水重新溶解，使用PD-10预装脱盐柱进行脱盐纯化，得到高蛋白浓度的洗脱液；

步骤E：重新收集洗脱液于离心管中，每管20mL，冷冻干燥成粉末，然后再用2mL去离子水重新溶解，得到高浓度的复合再生因子。

2.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，一号Neurobasal培养基的具体配制为：每100mL的Neurobasal培养液中，添加1mL的B27和500ng的noggin。

3.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，二号Neurobasal培养基的具体配制为：每100mL的Neurobasal培养液中，添加500ng的bFGF、1000ng的EGF5以及1mL的N2添加物。

4.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，诱导形成的神经干细胞纯度大于90％。

5.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤C中的离心处理具体是指：将细胞和培养基转移至50mL离心管中，以3000rpm的速度离心10min。

6.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于，所述步骤D中脱盐纯化的具体步骤包括：

步骤D1：平衡，采用PBS平衡PD-10柱；

步骤D2：上样，在PD-10柱平衡后，将溶解后的神经干细胞培养液加到柱子顶上；

步骤D3：洗脱：培养液全部进入柱子内后，从柱顶加入PBS以自然流速进行洗脱；

步骤D4：收集，从加样开始计算，用1.5mL的EP管收集流出液为脱盐蛋白峰，每管收集0.5mL；

步骤D5：检测，采用BCA方法检测每管总蛋白浓度，采用ELISA试剂盒检测各管的特定再生因子浓度，将蛋白浓度比高于5ug/mL的样品液合并后收集得到纯化的洗脱液。

7.根据权利要求6所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤D5中，每15mL神经干细胞培养液可以收集2mL纯化的洗脱液。

8.权利要求1所制备的神经干细胞来源的复合再生因子在中枢神经系统损伤中作为干细胞衍生治疗药物的应用。

9.一种用于中枢神经损伤的干细胞衍生治疗药物，其特征在于：其活性成分为采用权利要求1所述的方法而制备的神经干细胞来源的复合再生因子。