[发明专利]一株tetR26169基因敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用

说明书

一株tetR26169基因敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用，所述tetR26169基因敲除的须糖多孢菌工程菌株，由转录调控因子tetR26169在须糖多孢菌基因组中阻断所产生。本发明之tetR26169基因敲除的须糖多孢菌工程菌株，即须糖多孢菌S.pogona‑ΔtetR26169，于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2019069。PCR鉴定结果表明，须糖多孢菌基因组中tetR26169基因已被成功敲除。菌体OD₆₀₀测定及扫描电镜分析发现，工程菌株tetR26169的生长及菌丝体形态没有受到影响。摇瓶发酵结果显示，工程菌株须糖多孢菌S.pogona‑ΔtetR26169丁烯基多杀菌素产量与原始菌株S.pogona相比提高了2.1倍。

技术领域

本发明涉及一株须糖多孢菌tetR26169基因敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用。

背景技术

我国农业害虫种类多样，为有效控制这些严重威胁我国农业生产的鳞翅目、鞘翅目和刺吸式口器害虫等重大虫害，长期以来，一直依赖化学农药。然而，高毒有残留化学农药的持续使用已经造成了严重的环境污染和生态破坏，也严重影响着我国农产品的安全和出口。因此，开发对生态环境友好、对人畜安全的高效的生物农药显的尤为迫切。

丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)，是由土壤放线菌须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)经好氧发酵产生的具有触杀及摄食毒素的新型微生物源杀虫剂，因作用方式独特、选择性高、对非靶标动物安全及降解产物安全等优异特性，以及具有比多杀菌素更为广泛的杀虫谱，使其成为当今世界上最具发展前景的新型生物农药。然而，野生型须糖多孢菌丁烯基多杀菌素产量极低且不稳定，发酵周期长等，严重制约着丁烯基多杀菌素的发酵生产和应用。同时，国内外对须糖多孢菌在分子水平上的定向改造，很少有报道。主要由于须糖多孢菌具有强大的限制修饰系统以及外源基因难以转化，导致须糖多孢菌工程菌株的获得极为困难。CRISPR/cas9系统是一种存在于原核生物中的，用来抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统，主要是细菌通过产生一个蛋白质-RNA复合物,其中RNA负责识别外源DNA，而蛋白质则作为核酸酶，最终切割入侵者的遗传物质。目前，该技术已成功在某些特定的原核生物中进行基因组编辑，如大肠杆菌、链霉菌和拜氏梭菌等。

TetR家族转录调控因子是一类在多种放线菌、细菌中普遍存在的转录调节子家族，含有保守的螺旋-转角-螺旋DNA结合区域(形成同型二聚体)，且一般作为转录抑制子。它们的功能是广泛调节细胞活动(包括药物溢出、抗生素合成、氨基酸代谢等)。在链霉菌中，大多数TetR家族转录调控因子都能影响次生代谢产物的生物合成。如Gou等人在教酒链霉菌中敲除calR基因(TetR家族转录调控因子)后，卡西霉素的产量提高了8倍。本发明基于须糖多孢菌全基因组测序及定量蛋白质组数据分析，找到了一个属于TetR转录调控家族的基因—TetR26169(SP_1288)，且在其它链霉菌属中并未报道。该基因大小为702个碱基，编码含有223个氨基酸残基的小分子量DNA结合蛋白，分子量约为26.51kDa。

目前，有关在须糖多孢菌中进行单个基因敲除研究还未见有报道，采用常规同源重组技术对须糖多孢菌基因组进行编辑存在很大的困难，基于CRISPR/cas9技术在须糖多孢菌基因组编辑中的应用也很少见有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株须糖多孢菌tetR26169基因敲除的工程菌株，应用该工程菌株进行丁烯基多杀菌素生物合成，可以大幅提高丁烯基多杀菌素的产量。