[发明专利]基于差异SNP标记物的同源基因的融合检测方法

说明书

本发明涉及基于差异SNP标记物的同源基因的融合检测方法，本发明的融合检测方法利用两基因的差异SNP信号进行区分，绕过测序深度差异，利用双端reads的插入片段长度异常和单端reads的软截断(soft clip)信号，进行每个测序reads序列与同源基因序列进行一致性比较，寻找连续一致性SNP mark，由此推断得到断点区间。本发明的融合检测方法能得到断点所在区间，即前半部分最后一个位点和后半部分第一个位点，且此区间的间距依赖于检测出来的这两个位点的物理距离，以规避掉常规结构变异检测方法在重复序列检测中遇到的检测不出的问题。

技术领域

本发明涉及DNA测序领域，特别是涉及基于差异SNP标记物的同源基因的融合检测方法。

背景技术

DNA(脱氧核糖核酸)测序，是广泛应用于生物学研究中的一种重要的实验技术，在DNA双螺旋结构学说发表之后就开始有相关的报道，但是操作流程复杂而没有形成规模。

在1977年，末端终止测序法在Sanger的研究努力下诞生了。Sanger测序是先将基因组DNA片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)终止，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。其荧光标记的产物梯度，在测序仪的96或384毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。然而Sanger测序也存在自身的缺点，测序成本高、通量低、耗时长，严重影响了其真正大规模的应用。

随着科学技术的不断发展，二代NGS测序技术应运而生。将片断化的基因组DNA两侧连上接头，随后运用不同的方法来产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列(polony)。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成，之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷贝和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。按照测序范围来分：主要包括全基因组测序、全外显子组测序和目标区域捕获测序。

目前，利用主流测序技术完成模式生物或非模式生物的基因组测序的过程基本包括以下步骤：

1.文库制备：将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。

2.锚定桥接：Illumina测序平台在测序时，将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即Flow cell)。Flow cell被细分为多个通道，每个通道的内表面有无数的被固定的单链接头。将上一个步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。

3.预扩增：单链桥型待测片段会被扩增成双链桥型片段，在变性过程中释放出互补的单链会被锚定到附件的固相表面，数次循环之后，会在固相表面形成上百万条成簇分布的双链待测片段。

4.测序：单碱基延伸测序在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为碱基信号，从而获得待测片段的序列信息。

5.数据处理。Illumina测序得到的序列的每一个碱基都会有相应的测序质量，测序质量低，说明该碱基测错的概率就大。因此，通常在做样本的变异检测分析前，通过设置不同的阈值过滤质量较低的序列。