[发明专利]一种微流控分选芯片及其分选系统

说明书

本发明提供了一种微流控分选芯片及其分选系统，属于细胞分选技术领域，该微流控分选芯片包括从上向下依次堆叠的气路控制层、PDMS薄膜层、流体通道层和石英玻璃基底，该分选系统包括激光光镊拉曼光谱系统以及上述细胞微流控分选芯片。本发明提出的“七岔路结构”微流控分选芯片能够实现检测细胞的自动引导、检测与分选，提升了原代胰岛细胞分选的效率和准确性，基于该芯片设计的分选系统采用了图像识别、拉曼光谱检测、微流控技术等，可以高效、自动、无损的纯化原代胰岛α、β、δ、ε以及pp细胞，使原代胰岛在能够在单细胞水平上进行研究，解决了本领域内的重要技术问题。

技术领域

本发明属于原代胰岛细胞分选技术领域，具体涉及一种微流控分选芯片及其分选系统。

背景技术

哺乳动物的胰腺分为外分泌部和内分泌部。外分泌部中的腺泡分泌胰液，而内分泌部胰岛分散于外分泌部内。胰岛由四种不同的内分泌细胞组成，它们分别是产生胰高血糖素的α细胞、产生胰岛素的β细胞、产生生长抑素的δ细胞和产生胰多肽的pp细胞。

目前体外研究胰岛细胞的细胞模型主要有α及β细胞肿瘤克隆产生的胰岛细胞瘤细胞系以及动物活体取材获得的原代胰岛细胞。相对于肿瘤细胞而言，原代细胞最接近机体本身的生物学属性，对外界环境的变化也最敏感，更适合生理机制等方面研究。如细胞膜离子通道、细胞胞吐、细胞器的转运、细胞内质网中胰岛素蛋白质折叠等细胞电生理、细胞动力学研究均需要纯化活性良好的胰岛细胞作为研究对象。但因其分离纯化α、β、δ及pp等内分泌细胞极其困难，限制了原代胰岛在单细胞水平上的研究。

现有技术中，早在1981年D.G.Pipele等根据成熟的胰岛β细胞的直径较α细胞略大及它们之间沉降率的差异，利用密度梯度离心法对β细胞进行纯化。由于胰岛中β细胞质直径、沉降率并不是恒定的参数，例如在细胞分裂、增值、成熟等进程中细胞的直径、沉降率均会改变。所以，该方法的结果并不可靠。自1982年Van De Winkel等根据胰岛β细胞自发荧光的特点，利用流式细胞术对其进行纯化。之后M.J.Smelt等又将其方法改进，进而成为目前分离纯化胰岛β细胞的主流方法。近年来，还发展出利用单克隆抗体免疫磁珠、锌离子探针、绿色荧光蛋白标记等技术实现原代β细胞的分离纯化。然而，上述种种方法均无法有效兼顾细胞得率、纯度、细胞活性、引入外来混杂因素等。

对于胰岛α细胞而言，目前主要利用转基因技术建立胰岛素启动子-绿色荧光蛋白(mouse insulin promoter-green fluorescent protein，MIP-GFP)和luCre-ROSA26EYFP(GYY)小鼠，其绿色荧光蛋白分别标记于β细胞及α细胞，在荧光显微镜下发出绿色荧光。Quoix 等报道了一种利用Cre-LoxP重组酶系统建立的诱导性基因敲除小鼠模型GluCre-ROSA26EYFP (GYY) ，该模型中的其Cre重组酶在胰高糖素启动子的调控下合成，当胰高糖素合成时伴随着增强型黄色荧光蛋白（EYFP）表达，从而使α细胞带上荧光标记。因δ和pp细胞在胰岛中含量稀少且难以分离，其单细胞研究较少见。因免疫组织化学或免疫荧光鉴定需要破坏细胞，为保证研究细胞的活性，多数研究者采用先收集数据再免疫组织化学或免疫荧光鉴定的方法来对胰岛δ或pp细胞进行膜片钳等细胞电生理研究。

胰岛ε细胞是胰岛内新近发现的胰岛第五种内分泌细胞，它分泌的饥饿素最近被证明具有增强胰岛β细胞的自噬作用，抗凋亡等作用。因胰岛ε细胞含量仅占胰岛细胞总数1%，含量极少，活细胞下分离困难，目前还尚未见对胰岛ε单细胞研究的报道。

以上种种标记于胰岛细胞的各种抗体、探针、荧光蛋白甚至转染病毒等不仅带入新的混杂因素，还可能影响细胞的活性及功能。而先行收集数据再进行免疫组织化学或免疫荧光鉴定细胞类型的方法固然可靠，倘若研究对象是单个δ、pp细胞，因其含量稀少，研究者无异于在大海捞针。因此，发展一种无损的、不需染色的鉴别及纯化胰岛细胞的方法十分迫切。