[发明专利]一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法有效
申请号: | 201910291451.8 | 申请日: | 2019-04-12 |
公开(公告)号: | CN109959789B | 公开(公告)日: | 2022-08-16 |
发明(设计)人: | 殷玉和;石晶;刘伟;王慧慧;王倩;丁秋雨;赵玉环;倪婷婷;王莹;夏振强 | 申请(专利权)人: | 长春西诺生物科技有限公司 |
主分类号: | G01N33/569 | 分类号: | G01N33/569;G01N33/58;G01N33/531 |
代理公司: | 长春众邦菁华知识产权代理有限公司 22214 | 代理人: | 刘微 |
地址: | 130000 吉林*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 狂犬病毒 抗体 检测 试纸 及其 制备 方法 | ||
1.一种狂犬病毒抗体检测试纸,由一端至另一端依次包括:包被狂犬病毒抗原的样品垫、包被抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的金标垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、以及吸水垫,其彼此相互重叠并贴于背板的上表面;其特征在于,
其中,样品垫包被的狂犬病毒抗原为狂犬病毒样颗粒,样品垫包被的狂犬病毒抗原的蛋白浓度为0.5-2.0g/L,狂犬病毒样颗粒的基本组装元件包括狂犬病病毒G蛋白和M蛋白,其中G蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示,M蛋白基因序列如SEQ ID NO.2所示,狂犬病毒样颗粒是由狂犬病毒CTN-1株糖蛋白经Bac-to-Bac杆状病毒-Sf9昆虫细胞表达系统表达的病毒样颗粒;
检测线包被有抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体,检测线包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为1.0-2.0g/L;
质控线包被有金黄色葡萄球菌A蛋白,质控线包被的金黄色葡萄球菌A蛋白的蛋白浓度为1.0-2.0g/L;
抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体由胶体金标记,所述金标垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为50μg/ml;
并采用以下步骤制备:
S1、样品垫制备:制备和纯化狂犬病毒抗原,将纯化后的狂犬病毒抗原用内含2%的Tween-20的20mM四硼酸钠溶液稀释成0.5-2.0mg/ml,喷涂于玻璃纤维素膜上,作为样品垫;
S2、金标垫制备:用0.2mol/L K2CO3将25-40nm的胶体金溶液调节pH值为8.4后,将纯化后检验合格的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体按照蛋白浓度为50μg/ml,加入胶体金溶液中并继续搅拌30分钟;加入10%BSA至终浓度为1%,搅拌30分钟,以10000r/min离心30分钟,小心吸去上清液,沉淀物即为初步纯化的胶体金标记的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体,溶于含3%BSA、3%蔗糖、0.2%Tween-20和0.1%NaN3的20mmol/L Tris-HCl溶液,喷涂在玻璃纤维上,作为金标垫;
S3、硝酸纤维素膜包被:检测线包被的为1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体,包被液为含3%蔗糖的PBS,pH7.2;质控线包被的为1.0-2.0g/L的SPA,包被液为含3%蔗糖的PBS,pH7.2;
S4、试纸组装:采用样品单向层析组装方式,在背板上的一端至另一端依次粘贴狂犬病毒抗原包被的样品垫、吸附与狂犬病毒抗原相应的金标单克隆抗体纤维垫简称金标垫、硝酸纤维素膜上含有用纯化的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体溶液包被的检测线和SPA包被的质控线、吸水垫,组装后切条、密封,4-30℃保存。
2.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体检测试纸的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、样品垫制备:制备和纯化狂犬病毒抗原,将纯化后的狂犬病毒抗原用内含2%的Tween-20的20mM四硼酸钠溶液稀释成0.5-2.0mg/ml,喷涂于玻璃纤维素膜上,作为样品垫;
S2、金标垫制备:用0.2mol/L K2CO3将25-40nm的胶体金溶液调节pH值为8.4后,将纯化后检验合格的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体按照蛋白浓度为50μg/ml,加入胶体金溶液中并继续搅拌30分钟;加入10%BSA至终浓度为1%,搅拌30分钟,以10000r/min离心30分钟,小心吸去上清液,沉淀物即为初步纯化的胶体金标记的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体,溶于含3%BSA、3%蔗糖、0.2%Tween-20和0.1%NaN3的20mmol/L Tris-HCl溶液,喷涂在玻璃纤维上,作为金标垫;
S3、硝酸纤维素膜包被:检测线包被的为1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体,包被液为含3%蔗糖的PBS,pH7.2;质控线包被的为1.0-2.0g/L的SPA,包被液为含3%蔗糖的PBS,pH7.2;
S4、试纸组装:采用样品单向层析组装方式,在背板上的一端至另一端依次粘贴狂犬病毒抗原包被的样品垫、吸附与狂犬病毒抗原相应的金标单克隆抗体纤维垫简称金标垫、硝酸纤维素膜上含有用纯化的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体溶液包被的检测线和SPA包被的质控线、吸水垫,组装后切条、密封,4-30℃保存。
3.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体检测试纸的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
将待检全血或血清样本按1:50~1:100v/v稀释,取50~100μL加入样品垫上,室温静置10-20分钟内判定结果,结果判断方法为:
狂犬病病毒抗体阳性:质控线处,出现一条红色条带;肉眼观察检测线处,出现较弱的线甚至不显色;
狂犬病病毒抗体阴性:在检测线和质控线处,各出现一条紫红色条带;肉眼观察检测线越深,说明狂犬病病毒抗体越弱;
无效:仅在检测线显色,而质控线无明显条带出现,视为试纸条检测无效。
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