[发明专利]一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种谷氨酰胺转氨酶及其制备方法和应用。本发明通过提取枯草芽胞杆菌ATCC 23857基因组DNA，PCR扩增得到野生型带有酶原区的谷氨酰胺转氨酶btg基因序列，将扩增得到的野生型btg基因通过易错PCR进行随机突变，获得了一个突变体基因btgm。将突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型谷氨酰胺转氨酶。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种谷氨酰胺转氨酶及其制备方法和应用。

技术背景：

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，简称TG)，是一种可以催化酰基转移反应的酶，它能使蛋白质分子中赖氨酸残基上的ε-氨基和谷氨酰胺残基上的γ-羟酰胺基相互作用，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸键，使得蛋白质(或多肽)之间发生共价交联。从而改善蛋白质的结构和功能，影响蛋白质的性质，如发泡性、乳化性、乳化稳定性、热稳定性、保水性和凝胶能力等，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等，目前已经被广泛应用于食品、纺织、制药等领域。此酶在食品工业中得到了推广应用，如肉制品、乳制品、豆制品等。通过TG交联蛋白质，可以改变蛋白质的结构并提高其的功能性质，并且不破坏，甚至可以改善食品的营养。例如TG能显著改善大豆分离蛋白的弹性和硬度，能使蛋白质分子更紧密地结合在一起，故可提高大豆分离蛋白凝胶强度，从而改善其口感、质地和外观等。

然而目前，仅茂源链霉菌TG(简称MTG)实现了商业化生产并被广泛应用于食品加工中。但随着食品加工业范围不断扩大，食品加工底料品种与日俱增，MTG作为目前唯一生产和应用的TG酶种，其在底物特异性、热稳定性等方面已经不能很好地满足各种食品加工底物和加工过程的需求。与MTG相比，枯草芽胞杆菌TG(简称BTG)的性质有较大区别，可为食品加工提供一种新的选择。BTG与目前广泛研究的MTG相比，具有基因来源不同，底物特异性不同等优点，但是BTG比活力低，这也限制了BTG的商业化生产，因此我们通过分子改造的方式提高BTG的比活力。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶。其中，易错PCR是指在扩增目的基因的同时，利用Taq酶不具备3’→5’校对功能，同时改变反应体系中Mn²⁺、Mg²⁺和各种dNTP的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出连续易错PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的产物作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要的有益突变。因此，具有独有的优势。

芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。

因此，本发明中，基于TG在大肠杆菌中的表达平台，利用易错PCR技术，对来源于枯草芽孢杆菌的TG基因btg进行分子改造，并在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌体系中进行表达，以期得到酶活力提高的谷氨酰胺转氨酶。

发明内容：

本发明目的在于提供一种新型谷氨酰胺转氨酶及其制备方法和应用。

本发明实现上述目的的技术线路如下：