[发明专利]复制系统及其在基因表达中的应用

说明书

本发明提供获得目的基因表达产物的方法，包括在宿主菌中表达重组RNA分子，并在存在噬菌体RNA复制酶以及适合于目的基因表达的条件下培养所述宿主菌；其中所述重组RNA分子包含可被噬菌体RNA复制酶识别并进行RNA复制过程的5’复制识别序列和3’复制识别序列以及位于5’复制识别序列和3’复制识别序列之间的目的基因序列。本发明还提供可表达该重组RNA分子的重组菌。本发明的方法可以从直接增加RNA表达量的层面对工程菌进行改造，以促进目的基因的表达。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及含有可复制的RNA序列在复制酶作用下增强靶基 因信使RNA及蛋白质含量中的用途。

背景技术

微生物发酵是现代工业生产中制备食品药品的重要途径，其依赖于经过人工改造的工业微生物。 对于很多天然微生物不能生产或者生产不佳的代谢产物，可以利用代谢工程在底盘菌株中引入新的代 谢通路(Steen,E.J.,Kang,Y.,Bokinsky,G.,Hu,Z.,Schiremer,A.,McClure,A.,Del Cardayre,S.B.,and Keasling,J.D.(2010).Microbialproduction of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass.Nature,463,559.)和调节已有代谢通路(Varma,A.,and Palsson,B.O.(1994).MetabolicFlux Balancing: Basic Concepts,Scientific and Practical Use.Bio/technology,12.)，从而使目的产物得到表达或使其表 达产量得到显著提升。因此，构造能高效且稳定表达外源基因的工业菌株是微生物生产的核心步骤。

在过去的研究中，研究者们主要从以下四个层面对外源目的基因进行调节：DNA层面、转录层 面、RNA稳定性层面及翻译层面。DNA层面主要包括目的基因表达形式的选择，分别涉及基因组表 达和质粒表达。基因组表达相对稳定，突变及丢失情况低，但基因组的低拷贝数限制了其表达，同时 多个相同序列的插入会引发自发基因组重排问题；质粒系统表达能获得更高的目的基因拷贝数，但在 生产培养中存在着质粒易丢失(Smith,M.A.,andBidochka,M.J.(1998).Bacterial fitness and plasmid loss: the importance ofculture conditions and plasmid size.Canadian journal of microbiology,44,351-355.)、 承载量有限、抗性选择带来生长压力等问题。通常来讲，基因组作为目的基因的表达载体更为合适， 但由于表达量瓶颈所限工业生产仍以质粒表达为主，如何提升基因组上的目的基因表达量是目前亟待 解决的问题之一。转录层面主要包括对目的基因使用的启动子进行改造，目前已有大量研究，为菌种 改造提供了大量不同特性的启动子。RNA稳定性层面主要包括对信使RNA序列进行设计，从而减弱 其降解速率(Carrier,T.A.,andKeasling,J.D.(1997).Controlling messenger RNA stability in bacteria:strategies for engineering gene expression.Biotechnology progress,13,699-708.)，目前研究相对较少。 翻译层面主要包括对目的基因本身密码子使用及其5’序列(包括核糖体结合位点等)的改造，使之更 适合在工业菌中表达。综上，目前已有的研究从不同层面对工程菌进行了相应的优化改造，也取得了 长足的进步，但仍存在一些问题亟待解决。