[发明专利]一种雪蚤抗冻蛋白SF-P的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种雪蚤抗冻蛋白SF‑P的制备方法及应用。所述抗冻肽是通过合成雪蚤抗冻肽基因，构建原核表达载体后表达纯化得到的。首先将人工合成的SF‑P编码基因插入到PET28a‑sumo载体中，构建所述抗冻肽的表达质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，进行蛋白表达，用亲和层析法对蛋白进行纯化后进行酶切，获得SF‑P抗冻肽。大肠杆菌具有遗传稳定性，可以持续分泌表达外源基因，所获重组工程菌株，可以高量、稳定地分泌表达雪蚤抗冻肽SF‑P，在抗冻蛋白领域发挥了重要的作用。

技术领域

本发明属于生物与食品技术领域，具体地本发明涉及一种雪蚤抗冻蛋白SF-P的制备方法其应用。

背景技术

在寒冷环境中，生物体内的细胞环境会发生变化，具体表现为脱水形成结晶，因此造成细胞膜的破坏，进一步导致生物体受到损伤，为了适应极端寒冷环境，一些低温生物体内会产生一类多肽或糖肽，帮助它们抵御寒冻危险。这类多肽或糖肽称作抗冻肽(antifreeze peptide，AFP)，其由DeVries首在南极硬骨鱼中发现，随后证实具有抑制冰晶形成的功能。AFP具有特殊的抗冻活性，主要表现为：(1)能结合到冰晶表面并抑制冰晶进一步生长；(2)能以非依数形式降低溶液的冰点，使溶液的熔点和冰点之间出现差值，表现为热滞活性；(3)具有冰重结晶抑制效应。AFP可以避免细胞受到由冰晶导致的机械性损伤，因而其资源开发及应用引起了广泛关注，在农业低温育种、冷冻食品加工与储藏、医药行业上的广泛的应用发挥了一定的作用。

雪蚤抗冻蛋白(snow flea antifreeze protein,SF-P)首次发现于加拿大，富含甘氨酸。目前经过研究发现的雪蚤抗冻蛋白具有两种同种型模体，分子量分别为6.5kDa和15.7kDa，后者具有更高的抗冻活性。雪蚤蛋白可以通过使体液凝固点降低6℃的方法来抑制冰晶的生成，此功能有助于避免雪蚤在暴露的积雪地面上结冰。经过证实，雪蚤蛋白粗提物的热滞活性高达6℃，比在鱼类及植物中发现的大多数抗冻蛋白高一个或者两个数量级。但是因为自然条件的苛刻，雪蚤体内抗冻蛋白含量稀少，使得人们难以从雪蚤体内直接分离纯化，对其应用价值造成了限制。因此，雪蚤抗冻蛋白SF-P的高效制备成为了研究热点。大肠杆菌是目前广泛采用的进行活性蛋白或多肽生物表达的宿主，通过现代生物技术进行结合基因工程菌，可得到活性较高的雪蚤抗冻蛋白，将其运用于改善冻融产品的质量、产品储存、疾病治疗等领域中，具有极大的应用前景。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何高效表达雪蚤抗冻蛋白SF-P。

为实现上述目的，本发明提供了一种重组雪蚤抗冻肽SF-P的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；

步骤二：将含有所述抗冻肽表达序列的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，进行蛋白表达；

步骤三：用亲和层析法对表达蛋白进行纯化；

步骤四：使用蛋白酶切开纯化蛋白标签，获得所述抗冻肽。

进一步地，所述步骤一中，合成的的抗冻肽基因长度为252bp，其基因序列如SEQID NO.2所示。

进一步地，所述克隆载体包括标签序列，所述标签序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述步骤一中，所述克隆载体为PET28a-sumo载体。

进一步地，所述步骤二中，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

进一步地，所述步骤三中，所述亲和层析法中所用层析柱为镍柱。优选参数如下：填料：Ni-Smart 6FF，流速为2mL/min。

进一步地，所述步骤四中，所述蛋白酶为sumo蛋白酶，所切标签为His-sumo标签。