[发明专利]一种评价烟草特有亚硝胺对动物体暴露风险的方法

权利要求书

1.一种评价烟草特有亚硝胺对动物体暴露风险的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将TSNAs暴露动物的血液样品进行预处理，检测TSNAs及其代谢产物的含量；根据检测得到的血液样品中TSNAs及其代谢产物的含量对暴露时间绘制浓度-时间曲线，计算AUC值，根据代谢产物的AUC之和除以TSNAs的AUC之和计算α-羟基化系数；

将TSNAs暴露动物的肝脏组织样品进行预处理，检测O⁶-mG和O²-POB-dT的含量；根据检测得到的O⁶-mG和O²-POB-dT的含量值之和，获得代表性DNA加合物产量；

2）根据步骤1）得到的α-羟基化系数和代表性DNA加合物产量，评估α-羟基化代谢程度，预测TSNAs对动物体的暴露风险；

步骤1）中，所述TSNAs为NNK、NNN、NNAL、NAB，所述代谢产物为HPB、PBD、OPBA、OPBAA、HPBA、HPBAA；

采用高效液相色谱-串联质谱法测定TSNAs及其代谢产物的含量，采用内标法定量，NNK、NNAL、NNN、NAB的对应内标为NNK-d₄、NNAL-d₃、NNN-d₄、NAB-d₄；HPB、PBD、OPBA和HPBA的内标均为HPB-d₄；高效液相色谱-串联质谱法测定的色谱条件为：Waters Atlantis HILICsilica column色谱柱；柱温：25℃；进样量5μL，流速0.5mL/min；流动相A：10mmol/mL甲酸铵溶液，B：乙腈；洗脱梯度：0～2min内B由95%下降至85%，2～6min内由85%降至75%，于0.1min内升至95%，维持2min；高效液相色谱-串联质谱法测定的质谱条件为：电加热喷雾离子源，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气流速为9.9L/min，辅助气流速为3.3L/min，毛细管加热温度为320℃，加热器温度为300℃；扫描模式采用Full MS/ddMS²，一级全扫描分辨率为70000，范围为100～300m/z，自动增益控制为1e6，离子最大注入时间为50ms；二级扫描为数据依赖扫描，分辨率为17500，自动增益控制为1e5，最大注入时间为50ms，归一化的碰撞能量为35%；采用高效液相色谱-串联质谱法测定O⁶-mG和O²-POB-dT的含量，采用内标法定量；高效液相色谱-串联质谱法测定的色谱条件为：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱；柱温50℃；流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈；等度洗脱，流速0.20mL/min；进样量10µL；高效液相色谱-串联质谱法测定的质谱条件为：电加热喷雾离子源，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气流速为9.9 L/min，辅助气流速为3.3 L/min，毛细管加热温度为320℃，加热器温度为300℃；扫描模式采用Full MS/ddMS²，一级全扫描分辨率为70000，范围为100～400m/z，自动增益控制为1e6，离子最大注入时间为50ms；二级扫描为数据依赖扫描，分辨率为17500，自动增益控制为1e5，最大注入时间为50ms，归一化的碰撞能量为35%。

2.如权利要求1所述的评价烟草特有亚硝胺对动物体暴露风险的方法，其特征在于，步骤1）中，将TSNAs暴露动物的血液样品进行预处理包括：将血液样品进行离心分离，取上清液加入乙腈混合均匀，离心分离后取上清液。

3.如权利要求1所述的评价烟草特有亚硝胺对动物体暴露风险的方法，其特征在于，步骤1）中，将TSNAs暴露动物的肝脏组织样品进行预处理包括：将肝脏组织样品提取组织DNA，然后对组织DNA进行水解，固液分离，取固液分离后的液体过固相萃取柱，洗脱，洗脱液除去洗脱溶剂得到固体样品，固体样品用检测溶剂复溶，即得。