[发明专利]一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量及预测NNN暴露风险的方法

说明书

本发明涉及一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量及预测NNN暴露风险的方法，属于生物化学分析技术领域。本发明的方法通过测定血液中的NNN直接代谢产物及肝脏组织内NNN的间接代谢产物，在获得NNN及其代谢物的入体循环相对量的基础上，分别根据血液中α‑羟基化代谢途径产物总量与进入体循环的NNN相对量的比值和主要代谢器官内代表性DNA加合物的产量来评价NNN暴露后在不同个体内的α‑羟基化反应程度。本发明的方法评价结果准确、可靠，具有可比性，开创了一种新的可用于NNN早期暴露风险评估的方法。

技术领域

本发明涉及一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量及预测NNN暴露风险的方法，属于生物化学分析技术领域。

背景技术

TSNAs是烟草中特有的N-亚硝胺类有害成分，其中N’-亚硝基降烟碱(NNN)还被国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类人体致癌物质，其具有强烈的器官致癌活性，如与肺癌、胰腺癌等癌症的发生有关。目前认为，TSNAs的致癌作用是通过其在生物体内的代谢活化而产生的，因此研究TSNAs在生物体内的代谢历程显得尤为必要。

研究表明，NNN在机体内的代谢主要有三种途径，第一种是吡啶-N-氧化，第二种是吡啶环的羟基化(包括在2’和5’位置的α-羟基化)，第三种是去甲基可替宁的形成。虽然目前关于形成去甲基可替宁的作用说法不一，但与另一种研究较多的重要TSNAs——4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)类似，NNN的吡啶-N-氧化代谢途径是解毒过程，而其α- 羟基化代谢途径被认为是致毒过程。NNN通过2’位置的羟基化代谢途径生成不稳定的中间体—2’-羟基NNN，此中间体可以自发脱去一个HONO生成麦斯明(Myosmine)，也可以自发开环形成不稳定的吡啶氧丁基重氮氢氧化物，这种不稳定的吡啶氧丁基重氮氢氧化物可以攻击DNA生成相对稳定的POB-DNA加合物(如O²-POB-dT)，同时也可以与水反应最终生成PBD、HPB和OPBA，三者的总生成量可以反映NNN进行2’-羟基化代谢途径的程度；NNN 通过5’位置的羟基化代谢途径生成不稳定的中间体—5’-羟基NNN，随后自发开环形成不稳定的叠氮氢氧化物，也能与水反应生成内半缩醛，内半缩醛经过进一步转化转变为HPBA。总的来说，PBD、HPB、OPBA和HPBA是NNN的α-羟基化途径主要代谢产物。

虽然NNN的代谢途径及致癌效应较为清楚，但是目前有关NNN的研究主要集中于采用体外或体内模型直接考察NNN暴露后的毒理学机理，或停留于描述NNN在不同生物模型中的代谢特征。现有技术中，授权公告号为CN102445510B的中国发明专利公开了一种测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，该方法包括步骤：(1)肝微粒体孵育：在离心管中依次加入孵育液B、孵育液A、NNK，补加磷酸盐缓冲液配制成肝微粒体孵育体系；反应：将离心管置于水浴中加热，加入肝微粒体，混合均匀后，静置反应30min；(2)样品处理：取出反应产物，加入预冷的内标乙腈溶液终止反应，放入4℃冰箱中保存60min使蛋白沉淀， 3500rpm离心10min，取上清液于10000rpm离心5min，过滤；(3)液相-质谱联用测试。该方法前处理简单、分析速度快，可比较NNK在不同种属肝微粒体中的代谢。

目前现有技术中并没有建立从代谢分析角度直接评估NNN潜在致毒活性的量化指标，根据量化指标评价NNN暴露风险的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种预测NNN暴露风险的方法。该方法从代谢分析角度直接评价了NNN的暴露风险。

本发明还提供一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量的方法。该方法为评价NNN的潜在暴露风险提供基础。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种预测NNN暴露风险的方法，包括如下步骤：

(1)将肝脏组织进行水解、孵育，然后固液分离；