[发明专利]一种胎盘间充质干细胞快速分离与培养至收获冻存的方法

说明书

本发明公开了一种胎盘间充质干细胞快速分离与培养至收获冻存的方法，包括步骤一，组织分离；步骤二，组织块制备；步骤三，接种铺瓶；步骤四，原代细胞观察与换液；步骤五，原代细胞传代；步骤六，细胞冻存；该方法，步骤简单易操作，成本低，效率高；增加了干铺这个步骤，能够有效的缩短胎盘间充质干细胞爬出时间，缩短到达收获的时间，进一步缩短了生产周期；通过剥取胎盘特定部位的组织块，大大降低了杂细胞数量，能够得到单一的成纤维间充质干细胞，保证免疫表型的占比；传代和冻存步骤的优化提高了胎盘间充质干细胞的原始性和活率，在简化操作步骤和优化实验条件下使得胎盘间充质干细胞爬出速度加快，大量减少了人力、物力、财力。

技术领域

本发明涉及胎盘间充质干细胞分离培养技术领域，具体为一种胎盘间充质干细胞快速分离与培养至收获冻存的方法。

背景技术

在胎盘间充质干细胞的提取过程中，已有技术步骤如下：

1.原代组织剥取步骤：酒精擦拭胎盘容器外壁，取出胎盘置于无菌盘内，生理盐水冲洗胎盘组织，分离出羊膜组织、绒毛膜组织和蜕膜组织，清洗后取适量分别置于不同离心管内剪碎；

2.组织块消化步骤：加入胶原酶置于恒温振荡器进行消化反应，完成后用生理盐水进行过滤得到各个组织的细胞悬液；

3.接种处理步骤：去除上清液后加入培养基吹打混匀，然后不同组织细胞接种于不同培养瓶进行培养；

4.原代细胞培养及收获步骤：达到原代细胞培养预设时间后，进行换液处理；当细胞克隆团面积百分比与预设面积一致时，进行消化处理获得P0细胞；

5.原代细胞传代步骤：消化后离心弃上清，加入培养基，悬浮细胞后取样计数，将用于传代的P0细胞转入培养瓶培养，当细胞融合度与预设细胞融合度一致时，可选择继续传代或冻存。

现有技术操作繁琐，需要大量操作，并且胎盘间充质干细胞爬出时间长，杂质细胞含量高，细胞活性低等，采用酶消化法会使杂细胞过多，采用一般贴壁法无法保证细胞能正常生长，导致获得的细胞过杂或者无法获得胎盘间充质干细胞而使得样本废弃，浪费了大量的人力、物力、财力。因此设计一种胎盘间充质干细胞快速分离与培养至收获冻存的方法是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胎盘间充质干细胞快速分离与培养至收获冻存的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种胎盘间充质干细胞快速分离与培养至收获冻存的方法，包括步骤一，组织分离；步骤二，组织块制备；步骤三，接种铺瓶；步骤四，原代细胞观察与换液；步骤五，原代细胞传代；步骤六，细胞冻存；

其中在上述步骤一中，组织分离包括以下步骤：

1）取出胎盘，75%酒精浸泡，再用盐水清洗3遍；

2）取部分绒毛膜组织清洗，放入50mL离心管内；

其中在上述步骤二中，将组织块清净，用无菌医用手术剪将组织块机械剪碎成匀浆；

其中在上述步骤三中，接种铺瓶包括以下步骤：

1）用细胞刮刀将组织块匀浆铺在培养瓶内；

2）放入二氧化碳培养箱进行干燥培养；

3）再加入培养基，放置二氧化碳培养箱中培养；

其中在上述步骤四中，铺瓶后绝对静置七天，第八天在显微镜下观察，根据生长状态对培养瓶内培养基进行换液处理；

其中在上述步骤五中，显微镜下观察，达到传代融合度时，进行传代；

其中在上述步骤六中，显微镜下观察，达到收获融合度时，进行冻存。