[发明专利]一种高度特异性的单分子荧光检测方法有效

专利信息
申请号: 201910299030.X 申请日: 2019-04-15
公开(公告)号: CN110208226B 公开(公告)日: 2020-06-16
发明(设计)人: 苏昕;蔡爽;喻长远;李丽丹;邓莹楠 申请(专利权)人: 北京化工大学
主分类号: G01N21/64 分类号: G01N21/64;G01N1/28
代理公司: 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人: 王春霞
地址: 100029 *** 国省代码: 北京;11
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 高度 特异性 分子 荧光 检测 方法
【说明书】:

发明公开了一种高度特异性的单分子荧光检测方法。所述单分子检测方法包括如下步骤:(1)将两条识别探针与待检测的目标物结合,形成复合物;(2)将捕获探针固定于玻片上,并加入复合物,捕获探针与一条识别探针结合;(3)向玻片上加入带荧光标记的信号探针,信号探针与两条识别探针动态结合;(4)将玻片置于显微镜载物台上进行监测,利用电子增强型相机记录单分子荧光时间影像序列,筛选得到荧光强度‑时间轨迹呈现ON‑OFF交替变化且荧光的ton和toff相对较短的单分子点即为目标物。本发明能够在单分子水平直接指认目标物分子,高度可信的区分目标物与非目标物,可以大幅度提高单分子荧光检测的灵敏度、特异性和重复性。

技术领域

本发明涉及一种高度特异性的单分子荧光检测方法,属于单分子检测领域。

背景技术

生物分子识别与检测对于基础生物学研究和诊断具有重要的意义。一些关键的生物分子(核酸、蛋白等)在检测体系中浓度较低,一般需要扩增或信号放大以提高灵 敏度,但扩增过程易受干扰,导致假阳性或假阴性信号。过去二十年显微技术与照相技 术的发展使探测单个生物分子变为现实。单分子检测不仅灵敏度高,而且定量方式简单,样 品需求量少。单分子水平的探测能够揭示单分子异质性,提供更为丰富的信息,这为准确识 别生物分子提供了可能。单分子荧光传感主要基于全内反射荧光(TIRF)显微镜,能够 在单个分子水平探测目标物,具有超高的灵敏度。在TIRF的激发模式下,只有靠近 界面100nm以内的荧光分子能够被激发,从而大大降低溶液中的背景信号。分子探针 (核酸探针、抗体、核酸适配体等)在单分子荧光检测中广泛使用。但是在复杂体系 中,分子探针易与其他物质发生非特异性相互作用。尤其当目标物浓度较低时,目标 物所提供的荧光点数只占基底检测到的荧光点数的较少部分,难以通过简单的对照实 验扣除背景的荧光点来确认目标物的检出,从而难以达到较高的灵敏度和较低的检测 限,而且会影响检测的重复性和可靠性。在单分子水平直接区分目标物与非目标物是 提高单分子检测可靠性的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高辨识度信号的匹配单分子荧光检测的通用型探针系统,以及利用这种系统的高度特异性的单分子检测方法,可以用于核酸、蛋白以 及代谢小分子检测。

本发明所构建的单分子荧光检测探针系统基于由核酸纳米结构构建的动态three-way junction(TWJ)模型。

所述单分子荧光检测探针系统包括带荧光标记的信号探针和能与待检测的目标物结合的两条识别探针;

当两条所述识别探针均与待检测的目标物结合时,会诱导两条所述识别探针与所述信号探针之间的结合稳定度的变化,即荧光强度-时间轨迹呈现ON-OFF交替变化。

具体地,一条所述识别探针由捕获探针结合域、目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成;

另一条所述识别探针由目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成;

一条所述识别探针通过所述捕获探针结合域与捕获探针形成稳定结合,所述捕获探针结合域的长度至少为20个碱基;

两条所述识别探针均通过所述目标物结合域与目标物形成稳定结合;

两条所述识别探针均通过所述信号探针接收臂与所述信号探针形成动态结合,即,两条所述识别探针通过所述信号探针接收臂的组装,共同与所述信号探针形成动 态杂交;

所述短互补桥主要起到一个缓冲区段的作用,互补桥足够短才能确保在无目标物结合时,两条所述识别探针不会通过所述短互补桥结合,所述短互补桥的长度至多为 4个碱基。

具体地,所述信号探针与所述信号探针接收臂互补的碱基个数为5~7个;

所述信号探针与所述信号探针接收臂相互作用区段的GC含量≤50%;

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于北京化工大学,未经北京化工大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201910299030.X/2.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top