[发明专利]一种MSTN纳米抗体、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种MSTN纳米抗体，其特征在于，所述MSTN纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种如权利要求1所述MSTN纳米抗体的检测方法，其特征在于，所述MSTN纳米抗体的检测方法包括：

1）感受态细胞的制备

将保存的DH5α进行平板画线培养，挑取单克隆菌落；将挑取的菌落，加入5 mL LB培养基中，进行过夜培养；第二天，转接到50 mL 培养基中，培养至对数生长期；取对数生长期的DH5α进行冰浴；使用高速低温离心机进行离心，收集沉淀；向沉淀注入6 mL低温0.1 molCaCl2悬浮沉淀；分装，液氮中速冻，放入-80℃冰箱保存；

2）转化进表达菌DE3：

将连接好的产物加入到EP管中，调节水浴锅到42℃，迅速将EP管放入，期间不断摇动，反应时间90 s；将EP管取出，放于冰上2 min；离心，取沉淀涂平板，加入30µg/ml卡那霉素、34µg/ml氯霉素；第二天，将单克隆挑取；

蛋白的诱导表达：

挑取单克隆过夜培养；取培养液100 µL加入到20 mL含有Kana和氯霉素的培养基中，诱导表达至对数生长期；加入终浓度为0.5 mmol的IPTG ；分装到不同的三角瓶中；设置不同的条件：第一瓶，使用15℃，过夜摇床培养；第二瓶，25℃，过夜诱导；第三瓶，37℃，220r/min培养4 h；未添加IPTG的组设置为阴性对照；4000 r/min收集细菌，向沉淀中加入500µL PBS反复吹打；进行超声破碎，收集上清与沉淀；将收集到的沉淀使用包涵体溶解液进行溶解；将样品加入protein loading buffer，煮沸10 min；

3）SDS-PAGE检测：

制备12%分离胶，将分离胶混匀，加入制胶器中，将产生的气泡使用使用长针挑出，不能在胶内留有气泡；使用移液器将乙醇加入分离胶上方；20 min 后，将乙醇倒出；等待乙醇挥发干净之后，制备5 % 浓缩胶加入，并插入梳子；将制胶器放于试验台静置 2 h；将梳子从胶上取下；将胶放入电泳槽中，加入1×电泳液；赶出空隙之中的气泡；将双价绵羊MSTN纳米抗体样品加样至浓缩胶中，每孔8 微升，加入蛋白Marker；调节电压为80 V，30 min进行浓缩胶电泳；分离胶120V，60 min；3-4 h 后，等待溴酚蓝到达胶底时，停止电泳；将胶分离下来，放置于去离子水中进行清洗；浸入染色液中，于恒温摇床上染色35 min；配制新鲜脱色液，于恒温摇床上多次脱色至条带清晰，当胶脱色干净时，停止脱色；使用去离子水清洗；放置于Bio-RAD凝集成像仪中，矫正胶的位置，调节图案颜色以及对比度；

4）ELISA验证蛋白活性：使用包被液稀释MSTN蛋白，包被ELISA板，200ng /孔，4度过夜孵育；PBST洗涤3次；使用5%PBSM100微升每孔，37摄氏度孵育1小时；PBST洗涤3次；将纳米抗体梯度稀释100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000倍，对照组加入PBS，加入100微升每孔，37摄氏度孵育1小时；PBST洗涤3次；加入10000倍稀释的抗羊驼的二抗100微升每孔，37摄氏度孵育1小时，PBST洗涤3次；加入显色液100微升，37摄氏度，孵育15分钟，加入终止液50微升，酶标仪读取OD值。