[发明专利]一种食品中米酵菌酸的检测方法及其应用

说明书

本发明的目的在于提供一种食品中米酵菌酸的检测方法及其应用，其检测方法包括如下步骤：1）制备米酵菌酸人工抗原：将米酵菌酸与载体蛋白偶联，制备米酵菌酸包被原和米酵菌酸免疫原；2）制备抗米酵菌酸的多克隆抗体：制备米酵菌酸免疫原对应的多克隆抗体；3）多克隆抗体特异性及灵敏度检测：包括酶标板的制备、抗体的制备、标准溶液的配制以及结果评价；本发明通过米酵菌酸与载体蛋白偶联制备了全抗原，并通过动物免疫成功制备了抗BA多克隆抗体。通过评价，本发明制备的抗原/抗体的性能完全能满足现场对米酵菌酸进行快速筛查的需求。

技术领域

本发明属于食品中毒素检测的领域，具体涉及食品中米酵菌酸的检测方法及其应用。

背景技术

米酵菌酸(Bongkrekic acid，BA)是椰毒假单胞菌产生的一种毒素，食入该毒素污染的食物可引起人或动物中毒，重者可致死。现阶段研究，在食品中米酵菌酸的检测方法常用的液相色谱-串联质谱法、固相萃取-高效液相色谱法、高效液相色谱-二极管阵列检测器结合固相萃取法、超高效液相色谱串联质谱法等。本研究建立的免疫学检测方法暂未有报道。

专利CN105403651A公开了一种米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法，检测灵敏度为50μg/kg；专利CN 108195954 A了一种全自动固相萃取-超高效液相色谱法快速测定食品中米酵菌酸含量的方法，包括食品样品预处理、提取溶液的净化、HPLC分析，得到食品样品中的米酵菌酸含量，检测灵敏度为2.5μg/kg；苏永恒等建立固相萃取-高效液相色谱方法测定食品中米酵菌酸含量，样品通过外标法进行定量检测，灵敏度为5μg/kg(苏永恒,张伟,张榕杰,et al.固相萃取-高效液相色谱法测定食品中米酵菌酸含量[J].中国卫生工程学,2017(04):34-35+40.)；苏肯明等建立了液相色谱-串联质谱法测定银耳中的米酵菌酸的新方法，检测灵敏度为5μg/kg(苏肯明,梁达清.液相色谱-串联质谱法测定银耳中的米酵菌酸[J].广东化工,2014,41(16):168-169.)；周鹏建立了快速测定银耳中米酵菌酸的超高效液相色谱串联质谱分析方法，样本检出限0.5μg/kg(周鹏.超高效液相色谱串联质谱法测定银耳中米酵菌酸[J].食品研究与开发，2015，36(22)：123-126)。

以上方法虽然可以精确定量，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，因此无法实现真正意义上的现场快速检测。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种食品中米酵菌酸的检测方法及其应用，由于免疫学检测技术具有高特异性和高选择性的特点，非常适用于复杂基质痕量组分的分离或检测，但由于市场上一直未有针对米酵菌酸检测的生物原材料(抗原/抗体)，使其免疫类的快速筛查产品无法成功开发。本发明通过米酵菌酸与载体蛋白偶联制备了全抗原，并通过动物免疫成功制备了抗BA多克隆抗体。通过评价，本发明制备的抗原/抗体的性能完全能满足现场对米酵菌酸进行快速筛查的需求。

本发明的技术方案如下：

一种食品中米酵菌酸的检测方法，包括如下步骤：

1)制备米酵菌酸人工抗原：将米酵菌酸与载体蛋白偶联，制备米酵菌酸包被原和米酵菌酸免疫原；

2)制备抗米酵菌酸的多克隆抗体：通过动物免疫制备多克隆抗体；

3)多克隆抗体特异性及灵敏度检测：包括酶标板的制备、抗体的制备、标准溶液的配制以及结果评价；

步骤1)中将米酵菌酸与载体蛋白偶联，保留米酵菌酸结构上的三个羧酸基团，制备得到具有母环结构的米酵菌酸人工抗原；