[发明专利]一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用

权利要求书

1.一种降糖肽Aglycin的重组表达方法，其特征在于，将Aglycin通过自剪切内含肽、连接肽与自组装肽进行连接，构建能在体外自剪切的重组表达载体，将重组表达载体在大肠杆菌体内表达，获得重组表达菌株；重组表达菌株加入诱导剂进行诱导表达，离心收集菌体，对菌体进行破碎离心后得到沉淀，经诱导剂切割并离心得到上清，然后对切割后上清进行纯化，获得高纯度Aglycin；所述自剪切内含肽为MxeGyrA，其核苷酸序列为SEQ ID No.2；所述自组装肽为ELK16，其核苷酸序列为SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Aglycin的核苷酸序列为SEQ IDNo.1；所述连接肽为PT linker，其核苷酸序列为SEQ ID No.3。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建：

以合成的含有Aglycin基因的质粒为模板，以Ag-F/R为引物对通过PCR技术扩增出Aglycin基因，并通过RF克隆将Aglycin和含自剪切内含肽-连接肽-自组装肽蛋白序列的pET30a载体连接在一起，构建出重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16；

所述Ag-F/R的序列如下：

Ag-F5′-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTTGCAACGGTGTTTGCTCT-3′

Ag-R5′- GGCGTCGCCGGTGATGCACATACGCATACCAGACGGGTGACGGCAGTA-3′。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将构建的重组表达载体通过化学转化的方法转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取转化平板上单克隆接种至LB液体培养基中进行种子液培养；将种子液接种到LB液体培养基中，进行发酵培养，当OD₆₀₀=0.6～0.8时，添加IPTG进行诱导表达；

（2）诱导表达结束后，离心收集菌体，用缓冲液重悬，高压破碎菌体后离心收集沉淀，用洗涤缓冲液重悬沉淀并经DTT诱导切割，将切割后样品离心得到上清，然后经超滤纯化，获得高纯度的Aglycin。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子液培养及发酵培养的条件为37℃，220rpm；所述种子液的接种量为1:100v/v。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：16~37℃诱导表达5~24h；所述IPTG的浓度为0.2~1Mm；所述DTT诱导切割的条件为：在4℃条件下，20~80mM切割4~16h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：16℃诱导表达24h；所述IPTG的浓度为0.2mM；所述DTT诱导切割的条件为：在4℃条件下，40mM切割12h。