[发明专利]应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法

说明书

本发明公开一种应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法，将构建完成的重组汉逊酵母阳性克隆株接种至液体培养基中，培养至对数期加入甲醇进行诱导表达，从加入甲醇进行诱导表达开始，直至发酵终点，定时对培养物进行采样并提取样品总RNA；使用一步法荧光实时定量PCR对所提取样品的总RNA进行反转录和扩增汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因；获得各样品汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因的扩增循环数，计算每个采样时间点的相对表达增量K（%），按照采样时间和K(%)值关系建立折线图即可。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法。

背景技术

汉逊酵母是一种耐热酵母，最适生长温度为37~43℃，最高生长温度达49℃。它体内含有一种特殊的甲醇代谢途径，此途径是在甲醇氧化酶（MOX）的催化下将甲醇氧化成甲醛和过氧化氢，甲醛可在甲醛氧化酶（FMD）和甲酸脱氢酶的作用下进一步氧化成二氧化碳，也可在二氢丙酮合成酶（DHAS）等的作用下通过木酮糖单磷酸途径生成碳水化合物，成为细胞物质；过氧化氢则在过氧物酶的作用下形成水和氧气。汉逊酵母细胞中，MOX、DHAS和过氧化物贮存于过氧化物体，细胞以葡萄糖为碳源时，过氧化物体的体积约占酵母细胞总体积的1%。细胞以甲醇为碳源时，相关的酶大量合成，过氧化物体急剧膨胀，其体积可达酵母细胞总体积的80%。当汉逊酵母表达外源蛋白时，合成的蛋白质可贮存在过氧化物体中，避免对细胞产生毒害且免受蛋白酶降解。

汉逊酵母表达系统是20世纪90年代发展起来的最为理想的外源基因表达系统之一，具有表达菌株遗传性质稳定、表达量高、生物活性好、培养密度高、生产成本低、适用于工业化大生产等优点，许多难以表达的基因在汉逊酵母中都得到高效表达。汉逊酵母表达系统该系统已成功表达了多个病毒样颗粒疫苗，如乙肝疫苗、戊肝疫苗、HPV疫苗等均获得了较好的表达量。

汉逊酵母在廉价的合成或半合成培养基上容易进行高密度发酵，菌体密度可达100~130g/L菌液，外源基因的表达量较高。除温度外，影响发酵和外源基因表达的培养条件还有培养基的无机盐成分、发酵液的pH值、通气量、蛋白胨和酪蛋白水解物等营养成分以及碳源的添加策略等。目前，在重组汉逊酵母的前培养和诱导工艺阶段只能通过菌数、pH、溶氧等参数来侧面的判定酵母的表达能力，大部分情况下仅仅是依靠经验来确定诱导发酵时间等工艺参数。受人为因素影响，有时所确定的诱导发酵时间并非最佳表达量时刻，直接影响发酵工艺的优化和产品质量的提升。

发明内容

本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法。

本发明的技术解决方案是：一种应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 将构建完成的重组汉逊酵母阳性克隆株接种至液体培养基中，培养至对数期加入甲醇进行诱导表达，从加入甲醇进行诱导表达开始，直至发酵终点，定时对培养物进行采样并提取样品总RNA；

b. 使用一步法荧光实时定量PCR对所提取样品的总RNA进行反转录和特异性扩增，所述特异性扩增是扩增汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因；

c. 获得各样品汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因的扩增循环数，分别记为、及；

d. 按下式计算每个采样时间点的相对表达增量K（%）：

；

e. 按照采样时间和K(%)值关系建立折线图，得到目的基因在重组汉逊酵母中诱导后随时间的表达速率。