[发明专利]一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法

说明书

本发明公开了一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法，属于激光点扫描显微领域，实现了对样品的双光子轴向超分辨成像。通过飞秒激光器发出超短脉冲激光，以实现荧光样品的双光子激发；通过空间光调制器对激发光进行相位调制，依次用轴向实心光斑和轴向空心光斑扫描样品，对得到的两幅扫描双光子图像进行权重差分最终得到轴向超分辨图像。相对于其他双光子轴向超分辨成像显微镜，该装置其结构简单，成像深度大，为生命科学和纳米技术提供了良好的研究手段。

技术领域

本发明涉及激光点扫描显微领域，具体地说，涉及一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法。

背景技术

双光子显微技术在生命科学领域的应用越来越广泛。相较于传统的单光子荧光显微技术，双光子可以实现更深的穿透深度，并且由于双光子激发需要较高的光子密度，因此双光子的吸收仅仅局限在焦点附近很小的范围内，一定程度上提高了轴向分辨率。

此外，双光子成像通常采用红外波段的激发光源，对活体细胞和组织的光损伤比较小，能够进行长时间的成像。虽然根据阿贝衍射理论计算，波长越长，衍射极限越大，但双光子由于其穿透深度深、光损伤较小、光学切片功能更好等优势被广泛运用在生物领域的研究。

当一个点光源经过成像系统后，由于衍射效应，会在像面上形成一个艾里斑，并用点扩散函数(Point Spread Function，PSF)来描述。在横向(x-y)，它的分布为贝塞尔函数，而在轴向(z)则可以用辛格函数(sinc)来描述。一般认为，轴向的分辨率会2～3倍差于横向分辨率。

但对轴向延展的生物组织，如对神经元成像，轴向分辨率的限制会极大程度地降低成像质量。目前双光子组织成像中也存在一些技术与方法，例如，双光子显微技术与自适应光学(Adaptive Optics)、光切片显微技术(Light Sheet Microscopy)、受激辐射损耗超分辨显微技术(Stimulation Emission Depletion Microscopy)等结合使用。

然而，系统的轴向分辨率仍未得到改善，这对于分析组织样本的轴向信息是不利的。可见，提高双光子成像的轴向分辨率对于生物研究的成像有着重要的研究意义与实用价值。

发明内容

本发明的目的为提供一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置，可实现对样品的轴向超分辨成像。

本发明的另一目的为提供一种轴向超分辨的双光子荧光显微方法，该方法基于上述轴向超分辨的双光子荧光显微装置实现。

为了实现上述目的，本发明提供的轴向超分辨的双光子荧光显微装置包括激发光路和探测光路，激发光路上沿光路依次布置有：

飞秒激光器，用于发出超短脉冲激光对荧光样品进行双光子激发；

第一半波片，用于调节设于飞秒激光器之后的光参量振荡器出射光的s光和p光的比例；

偏振分束器，与第一半波片配合，调节光路中的光强；

起偏器，使p偏振光入射到空间光调制器；

空间光调制器，用于将光斑调制成轴向空心光斑；

第二半波片，用于将线偏振光转换为圆偏振光，其后设有扫描系统和二色镜，激发光透过二色镜进入显微物镜，照明荧光样品，荧光样品产生的荧光经二色镜后反射进入探测光路；

探测光路上设有用于聚焦荧光的场镜和将探测到的光信号转换成为电信号并传至计算机的探测器；

计算机用于处理探测器传送过来的电信号，并控制振镜系统对样品进行x和y方向上的扫描以及控制显微物镜轴向移动进行z方向上的扫描。