[发明专利]一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株B2909

说明书

本发明属于动物传染病防制技术领域，涉及一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株B2909，该突变株含有牛分枝杆菌卡介苗FadD18的突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变位点位于基因组3925305位点后，位于为FadD18基因序列的581位点后，是一种新结构基因和功能基因。本发明的突变株为低黏附力，低侵袭力，高生长速度，与野生菌株无形态学差异。突变株B2909保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018866。本发明的突变基因及其突变株可望在牛分枝杆菌致病机理研究、免疫机制研究和制备防制牛结核病疫苗或药物中应用。

技术领域

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株B2909分离鉴定和制备方法。该突变株含有牛分枝杆菌卡介苗FadD18的突变体基因，相较于野生株，本发明的突变株为低黏附力和低侵袭能力，且后期生长速度显著高于野生株。

背景技术

结核病是一种重要的慢性消耗性人畜共患病，为单一病原所引起人类死亡的头号杀手，2017年该病已经导致了全球130万人的死亡[1]。在数千年的发展历史中，结核病的病原结核分枝杆菌以各种形式逃逸宿主的免疫应答，并与人类协同进化，为人类健康带来了巨大的威胁；多耐药及耐多药菌株的不断出现，更是对结核病的防治造成了巨大的障碍。自1921年法国官方将牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin，M.bovis BCG)作为人结核病的官方许可疫苗后，全球范围内再无获许可的结核病疫苗问世[2]。

牛分枝杆菌卡介苗的本质为牛分枝杆菌传代致弱株。经实验室多次连续传代培养后自然丢失其编码毒力因子的RD1区后所形成。虽然卡介苗毋庸置疑的拯救了数以万计的生命，其保护效力却十分有限。除能够对儿童结核性脑膜炎有效控制外，对成人的保护力极差。不仅如此，对许多特殊群体尤其是免疫低下群体(如艾滋病人)而言，卡介苗不仅无法实现其免疫保护功能，反而加速了结核病的发生，具有极大的安全隐患。即便如此，在从未间断的结核病疫苗开发过程中，至今却仍没有优于卡介苗的疫苗问世。因此，从不同角度探讨开发出不影响卡介苗保护效力，且针对免疫低下群体更为安全的卡介苗具有十分重要的意义。

卡介苗的毒力决定着疫苗的安全性。黏附及侵袭能力是衡量细菌毒力的关键指标，黏附和侵袭更是细菌感染宿主细胞、激发免疫学反应的重要一步。在分枝杆菌感染过程中，细菌最先被吸入肺泡腔，并与肺泡巨噬细胞互作，随后通过一系列通路或方式实现对宿主细胞的黏附并侵袭[3]。黏附力和侵袭力也因此成为了细菌的毒力相关因子，直接影响着细菌的毒力强弱，并与细菌的扩散密切相关[4]。当细菌侵入细胞，或细胞吞噬细菌后，细菌的胞内存活能力则可用来影射细菌毒力的大小。

通过缺失毒力相关因子来降低卡介苗的毒力是制备安全疫苗的重要研究方向。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一株重要的牛分枝杆菌低侵袭力突变体菌株(在本发明中简称为突变株)B2909，该突变株涉及的基因为FadD18，相对于野生型牛分枝杆菌呈现明显的低黏附能力和低侵袭能力，以及高生长速度，所示性状与所插入失活基因的毒力相关。

为了实现本发明的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛分枝杆菌卡介苗基因缺失突变体库中筛选得到一株侵袭能力显著降低的菌株B2909，该突变株含有FadD18基因，推测与脂质代谢及毒力相关。经验证，在感染A549细胞过程中，突变菌株黏附能力和侵袭能力显著降低。在7H9培养基中，该突变菌株生长速度在生长后期显著快于野生菌株。在7H11培养基中，该突变菌株单菌落形态与野生菌株相比无显著差别。本发明的突变菌株与突变基因的关系研究显示突变菌株所述表型与失活基因FadD18的毒力相关。黏附和侵袭是细菌实现感染的重要步骤，病原菌毒力能够直接影响着宿主的免疫反应水平。因此，牛分枝杆菌卡介苗B2909突变株的成功构建及其所涉及基因FadD18相关功能的研究将对阐明牛分枝杆菌属成员的相关致病机制及开发更为安全有效的疫苗具有重要的参考价值。